Escherichia Coli O157: H7 nukleinsyredetektionskit (PCR-fluorescerende probemetode/lyofilisering)
Kitbeskrivelse:
Kat.nr.FP103
Det bruges til hurtig påvisning og screening af E. coli O157:H7 i fødevarer, foder, vandprøver og miljøprøver.
Beskrivelser
Det bruges tilhurtig påvisning og screening af E. coli O157:H7 i fødevarer, foder, vandprøver og miljøprøver.
[Testprincip]
I henhold til princippet om fluorescerende PCR-teknologi er specifikke primere og Taqman-prober designet til det specifikke gen af Escherichia coli O157: H7 og detekteret af et fluorescerende PCR-instrument for at realisere påvisningen af Escherichia coli O157: H7 Kvalitativ påvisning af DNA.
Sættets indhold
Bemærk: ROX-kanalsonde er ikke inkluderet.
| Componenter | Specifikation | Qmængde |
| Buffer A | Rør | 1 |
| Buffer B | Rør | 1 |
| Positiv kontrol | Rør | 1 |
| Negativ kontrol | Rør | 1 |
Forventet brug
Det bruges til hurtig påvisning og screening af E. coli O157:H7 i fødevarer, foder, vandprøver og miljøprøver.
Opbevaringsbetingelser og udløbsdato
Opbevares ved -20℃ i mørke og undgå gentagen frysning og optøning.
Gyldighedsperioden er 12måneder, og produktionsdatoen fremgår af yderemballagen.
Instrumenter og forbrugsvarer
Fluorescerende kvantitativt PCR-instrument, pipettepistol og matchende spidser, vortexryster, minicentrifuge.
Brug
1. Prøvebehandling
1.1 Prøvetype: Dette sæt er velegnet til fødevarer, foder, vandprøver og andre prøver, der mistænkes for at være kontamineret med Escherichia coli O157:H7.For dybt forarbejdede kødprodukter, drikkevarer og andre stoffer, der indeholder pigmenter, skal de skylles for at undgå at påvirke fluorescenssignalopsamlingen.
1.2 Prøvebehandling: Se "GB 4789.10-2016 Fødevaresikkerhed National Standard Fødevaremikrobiologisk undersøgelse af Escherichia coli O157: H7-test" for prøveforberedelse, berigelseskultur og isolering af Escherichia coli O157: H7.
- Nucleinsyreekstraktion
Tag 20 mL berigelsesopløsning i et 1,5 mL centrifugerør, tilsæt 200 μL mikrobielt lysat (yderligere sæt er påkrævet), vortex i 30 sekunder, centrifuger kort og sæt til side.
Bemærkninger: Ekstraktionen af nukleinsyre fra lysatet bør være afsluttet inden for 10 minutter og kan ikke opbevares i lang tid.
3. Nukleinsyreamplifikation
3.1 Tænd for det fluorescerende kvantitative PCR-instrument til brug.
Buffer A og Buffer B fra sættet, smelt dem grundigt, og centrifuger kortvarigt.Tilføj 18 μL buffer A og 2 μL buffer B til hvert PCR-reaktionsrør.Tilsæt derefter 5 mL af hver af den negative kontrol, den ekstraherede nukleinsyre og den positive kontrol til PCR-reaktionsrørene, dæk rørene, og centrifuger kortvarigt.
3.3 Overfør PCR-reaktionsrøret til en fluorescerende PCR-maskine, og brug følgende procedurer til at udføre amplifikationseksperimenter: vælg 25 mL til reaktionssystemet, opsaml fluorescenssignaler ved 60°C for hver cyklus, og vælg FAM som detektionskanal.
| Trin | Program | Antal cyklusser |
| 1 | 37℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60℃ 30s (saml fluorescens) |
Vejledninger til problemanalyse
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Intet RNA kan ekstraheres, eller udbyttet af nukleinsyre er lavt
Der er normalt mange faktorer, der påvirker genvindingseffektiviteten, såsom: prøve-RNA-indhold, driftsmetode, elueringsvolumen osv..
Analyse af almindelige årsager:
1.Isbad eller lavtemperatur (4 °C) centrifugering under drift.
Forslag: Rumtemperatur (15-25 ° C) drift, aldrig isbad og lav temperatur centrifuge.
2. Forkert prøveopbevaring eller prøveopbevaring i for lang tid.
Forslag: Opbevar prøver ved -80 ° C eller frys i flydende nitrogen, og undgå gentagen fryse-optøning brug;prøv at bruge frisk indsamlede prøver til RNA-ekstraktion.
3.Utilstrækkelig prøvelysering
Anbefaling: Sørg for, at prøven og arbejdsopløsningen (lineær acrylamid) er blevet grundigt blandet og inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur (15-25 ° C)
4. Eluenten blev tilsat forkert
Anbefaling: Sørg for, at RNase-Free ddH2O tilsættes til midten af membranen i rensekolonnen
5. Forkert volumen vandfri ethanol i buffer viRW2
Forslag: Følg instruktionerne, tilsæt den korrekte mængde vandfri ethanol til Buffer viRW2 og bland dem godt, før du bruger sættet.
6.Ukorrekt prøvebrug.
Forslag: 200 µl prøve pr. 500 µl buffer viRL.For stort prøvevolumen vil resultere i reduceret RNA-ekstraktionshastighed.
7. Forkert elueringsvolumen eller ufuldstændig eluering.
Forslag: Rensningskolonnens eluentvolumen er 30-50μl;hvis elueringseffekten ikke er tilfredsstillende, anbefales det at tilføje forvarmet RNase-fri ddH2O og forlænge tiden ved at placere ved stuetemperatur, såsom 5-10 min
8. Oprensningskolonnen har ethanolrester efter skylning i Buffer viRW2.
Forslag: Hvis der stadig er ethanol tilbage efter skylning i buffer viRW2 og centrifugering med tomme rør i 2 minutter, kan rensekolonnen efterlades ved stuetemperatur i 5 minutter efter centrifugering med tomme rør for fuldstændigt at fjerne resterende ethanol.
Nedbrydningen af oprensede RNA-molekyler
Kvaliteten af det oprensede RNA er relateret til faktorer som prøveopbevaring, RNase-kontamination og drift.
Analyse af almindelige årsager:
1.De indsamlede prøver blev ikke gemt i tide.
Forslag: Hvis prøven ikke bruges i tide efter indsamling, skal den opbevares ved -80 ℃ eller flydende nitrogen med det samme.Til ekstraktion af RNA-molekyler, prøv at bruge frisk indsamlede prøver, når det er muligt.
2. Indsamlede prøver blev nedfryset og optøet gentagne gange.
Forslag: Undgå gentagen frysning og optøning (ikke mere end én gang) under prøvetagning og opbevaring, ellers vil udbyttet af nukleinsyre falde.
3.RNase blev indført på operationsstuen, eller der blev ikke brugt engangshandsker, masker osv..
Forslag: Eksperimentet med ekstraktion af RNA-molekyler udføres bedst i et separat RNA-operationsrum, og forsøgsbordet rengøres før forsøget.Bær engangshandsker og -masker under eksperimentet for at undgå RNA-nedbrydning forårsaget af RNase-introduktion.
4.Reagenset er kontamineret med RNase under brugen.
Forslag: Udskift med nyt viralt RNA-isoleringskit til relaterede eksperimenter.
5. RNase-kontaminationen af centrifugerørene, pipettespidserne osv. Forslag: Sørg for, at centrifugerørene, pipettespidserne og pipetterne alle er RNase-frie.
De oprensede RNA-molekyler påvirkede nedstrøms eksperimenter
RNA-molekylerne oprenset af oprensningssøjlen vil påvirke nedstrøms eksperimenter, hvis der er for mange saltioner eller proteiner, såsom: omvendt transkription, Northern Blot osv.。
1.Der er resterende saltioner i de eluerede RNA-molekyler.
Anbefaling: Sørg for, at den korrekte mængde vandfri ethanol er tilsat Buffer viRW2, og vask rensekolonnen to gange i henhold til den korrekte centrifugeringshastighed i betjeningsvejledningen. Hvis der stadig er saltioner tilbage, kan du tilføje Buffer viRW2 til rensekolonnen og lade den stå ved stuetemperatur i 5 min.Udfør derefter centrifugering for at fjerne forurening af saltioner i størst muligt omfang
2.Der er ethanol tilbage i de eluerede RNA-molekyler
Forslag: Når du har bekræftet, at rensningskolonner er blevet skyllet af Buffer viRW2, skal du udføre tomrørscentrifugering i henhold til centrifugalhastigheden i betjeningsvejledningen.Hvis der stadig er ethanol tilbage, kan den efterlades i 5 minutter ved stuetemperatur efter en centrifugering med tomme rør for at fjerne den resterende ethanol i størst muligt omfang.
Instruktionsmanualer:
Instruktionsmanual til viralt RNA-isoleringskit
