Forklaring af grundlæggende molekylærbiologiske termer
1. cDNA og cccDNA: cDNA er et dobbeltstrenget DNA syntetiseret af revers transkriptase fra mRNA;cccDNA er et plasmid dobbeltstrenget lukket cirkulært DNA frit fra kromosomet.
2. Standard foldeenhed: proteinets sekundære strukturenhed α-helix og β-sheet kan danne strukturelle blokke med specielle geometriske arrangementer gennem forskellige forbindende polypeptider.Denne type bestemt foldning kaldes normalt super sekundær struktur.Næsten alle tertiære strukturer kan beskrives af disse foldetyper, og endda deres kombinerede typer, så de kaldes også standard foldeenheder.
3. CAP: cyklisk adenosin monophosphat (cAMP) receptor protein CRP (cAMP receptor protein), komplekset dannet efter kombinationen af cAMP og CRP kaldes aktiverende protein CAP (cAMP aktiveret protein)
4. Palindromisk sekvens: Den omvendte komplementære sekvens af et segment af et DNA-fragment, ofte et restriktionsenzymsted.
5. micRNA: Komplementært interfererende RNA eller antisense RNA, som er komplementært til mRNA-sekvensen og kan hæmme translationen af mRNA.
6. Ribozyme: RNA med katalytisk aktivitet, som spiller en autokatalytisk rolle i splejsningsprocessen af RNA.
7. Motiv: Der er nogle lokale regioner med lignende tredimensionel form og topologi i den rumlige struktur af proteinmolekyler
8. Signalpeptid: et peptid med 15-36 aminosyrerester i N-terminalen under proteinsyntese, som styrer proteinets transmembran.
9. Attenuator: En nukleotidsekvens mellem en operatorregion og et strukturelt gen, der terminerer transkription.
10. Magisk plet: Når bakterierne vokser og støder på en fuldstændig mangel på aminosyrer, vil bakterierne producere en nødreaktion for at stoppe ekspressionen af alle gener.Signalerne, der genererer denne nødreaktion, er guanosin-tetraphosphat (ppGpp) og guanosinpentaphosphat (pppGpp).Rollen af PpGpp og pppGpp er ikke kun en eller nogle få operoner, men påvirker et stort antal af dem, så de kaldes superregulatorer eller magiske pletter.
11. Opstrøms promotorelement: refererer til DNA-sekvensen, der spiller en regulerende rolle i aktiviteten af promotoren, såsom TATA i -10-regionen, TGACA i -35-regionen, enhancere og attenuatorer.
12. DNA-probe: et mærket segment af DNA med en kendt sekvens, som er meget brugt til at påvise ukendte sekvenser og screene målgener.
13. SD-sekvens: Det er bindingssekvensen af ribosom og mRNA, som regulerer translation.
14. Monoklonalt antistof: Et antistof, der kun virker mod en enkelt antigen determinant.
15. Cosmid: Det er en kunstigt konstrueret eksogen DNA-vektor, der bevarer COS-regionerne i begge ender af fagen og er forbundet med plasmidet.
16. Blå-hvid plet-screening: LacZ-gen (koder for β-galactosidase), enzymet kan nedbryde det kromogene substrat X-gal (5-brom-4-chlor-3-indol-β-D-galactosid) for at producere blåt og dermed gøre stammen blå.Når det eksogene DNA indsættes, kan LacZ-genet ikke udtrykkes, og stammen er hvid for at screene de rekombinante bakterier.Dette kaldes blå-hvid screening.
17. Cis-virkende element: En specifik sekvens af baser i DNA, der regulerer genekspression.
18. Klenow-enzym: Stort fragment af DNA-polymerase I, bortset fra at 5'3'-exonukleaseaktiviteten fjernes fra DNA-polymerase I-holoenzymet
19. Forankret PCR: bruges til at amplificere DNA'et af interesse med en kendt sekvens i den ene ende.En poly-dG-hale blev tilføjet til den ene ende af den ukendte sekvens, og derefter blev poly-dC og den kendte sekvens anvendt som primere til PCR-amplifikation.
20. Fusionsprotein: Genet af eukaryotisk protein er forbundet med eksogent gen, og proteinet, der består af translationen af originalt genprotein og eksogent protein, udtrykkes på samme tid.
Andre molekylærbiologiske udtryk
1. Det fysiske kort over DNA er den rækkefølge, hvori (restriktionsendonukleasefordøjede) fragmenter af DNA-molekylet er arrangeret.
2. Spaltningen af RNase er opdelt i to typer (autokatalyse) og (heterokatalyse).
3. Der er tre initieringsfaktorer i prokaryoter er (IF-1), (IF-2) og (IF-3).
4. Transmembrane proteiner kræver vejledning (signalpeptider), og rollen som proteinchaperoner er (hjælper med at folde peptidkæden ind i proteinets native konformation).
5. Elementer i promotorer kan generelt opdeles i to typer: (kernepromotorelementer) og (opstrømspromotorelementer).
6. Molekylærbiologiens forskningsindhold omfatter hovedsageligt tre dele: (strukturel molekylærbiologi), (genekspression og regulering) og (DNA-rekombinationsteknologi).
7. De to nøgleeksperimenter, der viser, at DNA er det genetiske materiale, er (pneumococcus-infektion hos mus) og (T2-faginfektion af Escherichia coli).potentiel).
8. Der er to hovedforskelle mellem hnRNA og mRNA: (hnRNA splejses i processen med at konvertere til mRNA), (5'-enden af mRNA'et tilføjes med en m7pGppp-hætte, og der er en ekstra polyadenylering i 3'-enden af mRNA-syre-(polyA)-halen).
9. Fordelene ved multi-underenhedsformen af protein er (underenhed er en økonomisk metode til DNA-udnyttelse), (kan reducere virkningen af tilfældige fejl i proteinsyntesen på proteinaktivitet), (aktivitet kan være meget effektivt og hurtigt åbnes og lukkes).
10. Hovedindholdet i proteinfoldningsmekanismen første nukleationsteori omfatter (kernedannelse), (strukturel berigelse), (endelig omlejring).
11. Galactose har en dobbelt effekt på bakterier;på den ene side (det kan bruges som en kulstofkilde til cellevækst);på den anden side (det er også en del af cellevæggen).Derfor er en cAMP-CRP-uafhængig promotor S2 nødvendig for den permanente syntese på baggrundsniveau;samtidig er en cAMP-CRP-afhængig promotor S1 nødvendig for at regulere syntesen på højt niveau.Transskription starter fra (S2) med G og fra (S1) uden G.
12. Rekombinant DNA-teknologi er også kendt som (genkloning) eller (molekylær kloning).Det ultimative mål er (at overføre den genetiske informations-DNA i en organisme til en anden organisme).Et typisk DNA-rekombinationseksperiment omfatter normalt følgende trin: (1) Udtræk målgenet (eller det eksogene gen) fra donororganismen, og forbind det enzymatisk med et andet DNA-molekyle (kloningsvektor) for at danne et nyt rekombinant DNA-molekyle.② Det rekombinante DNA-molekyle overføres til modtagercellen og replikeres i modtagercellen.Denne proces kaldes transformation.③ Screen og identificer de modtagerceller, der har absorberet det rekombinante DNA.④ Dyrk cellerne, der indeholder rekombinant DNA i store mængder for at påvise, om fremmedhjælpsgenet udtrykkes.
13. Der er to typer plasmidreplikation: dem, der er strengt kontrolleret af værtscelleproteinsyntese, kaldes (tight plasmids), og dem, der ikke er strengt kontrolleret af værtscelleproteinsyntese, kaldes (afslappede plasmider).
14. PCR-reaktionssystemet bør have følgende betingelser: a.DNA-primere (ca. 20 baser) med komplementære sekvenser i hver ende af de to strenge af målgenet, der skal adskilles.b.Enzymer med termisk stabilitet såsom: TagDNA polymerase.c, dNTPd, DNA-sekvens af interesse som skabelon
15. Den grundlæggende reaktionsproces for PCR omfatter tre trin: (denaturering), (annealing) og (udvidelse).
16. Den grundlæggende proces for transgene dyr omfatter normalt: ①Introduktion af klonet fremmed gen i kernen af et befrugtet æg eller embryonal stamcelle;②Transplantation af det podede befrugtede æg eller embryonale stamcelle til den kvindelige livmoder;③Fuldstændig embryonal udvikling og vækst For afkommet med fremmede gener;④ Brug disse dyr, der kan producere fremmede proteiner, som avlsdyr til at avle nye homozygote linjer.
17. Hybridomcellelinjer dannes ved at hybridisere (milt B) celler med (myelom)celler, og da (miltceller) kan udnytte hypoxanthin og (knogleceller) give celledelingsfunktioner, kan de dyrkes i HAT-medium.dyrke.
18. Med uddybningen af forskningen kaldes første generation af antistoffer (polyklonale antistoffer), anden generation (monoklonale antistoffer) og tredje generation (genteknologiske antistoffer).
19. På nuværende tidspunkt er gensplejsningen af insektvira hovedsageligt fokuseret på baculovirus, som kommer til udtryk ved introduktionen af (eksogent toksin-gen);(gener, der forstyrrer insekternes normale livscyklus);(modifikation af virusgener).
20. De trans-virkende proteinfaktorer svarende til de fælles elementer TATA, GC og CAAT i pattedyrs RNA-polymerase II-promotoren er henholdsvis (TFIID), (SP-1) og (CTF/NF1).
enogtyve.De grundlæggende transkriptionsfaktorer for RNA-polymerase Ⅱ er TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E, og deres bindingssekvens er: (D, A, B, E).Hvor funktionen af TFII-D er (binding til TATA-boks).
to og tyve.De fleste af de transkriptionsfaktorer, der binder til DNA, virker i form af dimerer.De funktionelle domæner af transkriptionsfaktorer, der binder til DNA, er almindeligvis følgende (helix-turn-helix), (zinkfingermotiv), (basic-leucin) lynlåsmotiv).
treogtyve.Der er tre typer restriktionsendonukleasespaltningstilstande: (skåret på 5'-siden af symmetriaksen for at generere 5'-klæbende ender), (skær på 3'-siden af symmetriaksen for at generere 3'-klæbende ender (skær ved symmetriaksen for at generere flade segmenter)).
fireogtyve.Plasmid-DNA har tre forskellige konfigurationer: (SC-konfiguration), (oc-konfiguration), (L-konfiguration).Den første i elektroforese er (SC-konfiguration).
25. Eksogene genekspressionssystemer, hovedsageligt (Escherichia coli), (gær), (insekt) og (pattedyrcelletabel).
26. De almindeligt anvendte metoder til transgene dyr er: (retroviral infektionsmetode), (DNA-mikroinjektionsmetode), (embryonal stamcellemetode).
Anvendelse Molekylær biologi
1. Nævn funktionerne af mere end 5 RNA'er?
Transfer RNA tRNA Transfer aminosyre Ribosom RNA rRNA Ribosom udgør messenger RNA mRNA Proteinsynteseskabelon Heterogen nuklear RNA hnRNA Precursor for modent mRNA lille nuklear RNA snRNA Involveret i hnRNA splejsning Små RNA splejsning Små RNA scRNA/7SL-RNAs cytoplasmatiske RNA scRNA/7SL-RNAs cytoplasmatiske RNA scRNA/7SL-RNAs cytoplasmatiske RNA scRNA/7SL-RNAs cytoplasmatiske RNA-scRNA/7SL-RNA-recculum-RNA-genopbygget RNA-signal- RNA-genopbygget RNA-protein, retikuleret og RNA-synet RNA-legeme, retikuleret protein. /micRNA Regulerer genekspression Ribozyme RNA Enzymatisk aktivt RNA
2. Hvad er hovedforskellen mellem prokaryote og eukaryote promotorer?
Prokaryot TTGACA --- TATAAT------Initiationssted-35 -10 Eukaryotic Enhancer---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp-Initieringssted-110 -70 -25
3. Hvad er hovedaspekterne ved kunstig konstruktion af naturlige plasmider?
Naturlige plasmider har ofte defekter, så de er ikke egnede til brug som bærere til genteknologi og skal modificeres og konstrueres: a.Tilføj passende selektionsmarkørgener, såsom to eller flere, som er nemme at bruge til selektion, sædvanligvis antibiotiske gener.b.Forøg eller formindsk egnede enzymskæringssteder for at lette rekombination.c.Forkort længden, skær unødvendige fragmenter af, forbedre importeffektiviteten og øge lastekapaciteten.d.Skift replikon, fra stram til løs, fra færre kopier til flere kopier.e.Tilføj specielle genetiske elementer i henhold til de særlige krav til genteknologi
4. Giv et eksempel på en metode til differentiel screening af vævsspecifikt cDNA?
To cellepopulationer fremstilles, målgenet er udtrykt eller stærkt udtrykt i en af cellerne, og målgenet udtrykkes ikke eller lavt udtrykt i den anden celle, og derefter findes målgenet ved hybridisering og sammenligning.For eksempel vil tumorceller under forekomsten og udviklingen af tumorer præsentere mRNA'er med andre ekspressionsniveauer end normale celler.Derfor kan tumorrelaterede gener screenes ud ved differentiel hybridisering.Induktionsmetoden kan også bruges til at screene de gener, hvis ekspression er induceret.
5. Generering og screening af hybridomcellelinjer?
Milt B-celler + myelomceller, tilsæt polyethylenglycol (PEG) for at fremme cellefusion, og miltens B-myelomfusionsceller dyrket i HAT-medium (indeholdende hypoxanthin, aminopterin, T) fortsætter med at udvide sig nærer.Cellefusionen indeholder: milt-milt fusionsceller: ude af stand til at vokse, miltceller kan ikke dyrkes in vitro.Knogle-knoglefusionsceller: kan ikke udnytte hypoxanthin, men kan syntetisere purin gennem den anden vej ved hjælp af folatreduktase.Aminopterin hæmmer folatreduktase og kan derfor ikke vokse.Knogle-milt-fusionsceller: kan vokse i HAT, miltceller kan bruge hypoxanthin, og knogleceller giver celledelingsfunktion.
6. Hvad er princippet og metoden til at bestemme den primære struktur af DNA ved dideoxy-terminaltermineringsmetoden (Sanger-metoden)?
Princippet er at bruge en nukleotidkædeterminator-2,,3,-dideoxynukleotid til at afslutte forlængelsen af DNA.Da det mangler den 3-OH, der kræves til dannelsen af 3/5/phosphodiester-bindinger, når den først er inkorporeret i DNA-kæden, kan DNA-kæden ikke forlænges yderligere.Ifølge princippet om baseparring, når DNA-polymerase har brug for dNMP for at deltage i den normalt forlængede DNA-kæde, er der to muligheder, den ene er at deltage i ddNTP, hvilket resulterer i terminering af deoxynukleotidkædeforlængelsen;den anden er at deltage i dNTP, så DNA-kæden stadig kan fortsætte med at forlænge, indtil den næste ddNTP er inkorporeret.Ifølge denne metode kan en gruppe af DNA-fragmenter af forskellig længde, der ender på ddNTP, opnås.Metoden er at opdele i fire grupper henholdsvis ddAMP, ddGMP, ddCMP og ddTMP.Efter reaktionen kan polyacrylamidgelelektroforese aflæse DNA-sekvensen i henhold til svømmebåndene.
7. Hvad er den positive reguleringseffekt af aktivatorprotein (CAP) på transkription?
Cyklisk adenylat (cAMP) receptor protein CRP (cAMP receptor protein), komplekset dannet af kombinationen af cAMP og CRP kaldes CAP (cAMPaktiveret protein).Når E. coli dyrkes i et medium, der mangler glukose, øges syntesen af CAP, og CAP har den funktion at aktivere promotorer såsom lactose (Lac).Nogle CRP-afhængige promotorer mangler det typiske -35-områdesekvenstræk (TTGACA), som almindelige promotorer har.Derfor er det svært for RNA-polymerase at binde sig til det.Tilstedeværelsen af CAP (funktion): kan væsentligt forbedre bindingskonstanten for enzym og promotor.Det viser hovedsageligt følgende to aspekter: ① CAP hjælper enzymmolekylet med at orientere sig korrekt ved at ændre promotorens konformation og interaktionen med enzymet, så det kombineres med -10-regionen og spiller rollen som erstatning for -35-regionens funktion.②CAP kan også hæmme bindingen af RNA-polymerase til andre steder i DNA og derved øge sandsynligheden for binding til dens specifikke promotor.
8. Hvilke trin indgår normalt i et typisk DNA-rekombinationseksperiment?
en.Udtræk donororganismens målgen (eller eksogene gen), og forbind det enzymatisk til et andet DNA-molekyle (kloningsvektor) for at danne et nyt rekombinant DNA-molekyle.b.Overfør det rekombinante DNA-molekyle til modtagercellen og repliker og bevar det i modtagercellen.Denne proces kaldes transformation.c.Screen og identificer de modtagerceller, der har absorberet det rekombinante DNA.d.Massedyrk cellerne indeholdende det rekombinante DNA for at påvise, om fremmedhjælpsgenet udtrykkes.
9. Konstruktion af genbibliotek Tre metoder til screening af rekombinanter er givet, og processen er kort beskrevet.
Antibiotikaresistensscreening, insertioninaktivering af resistens, blå-hvid plet-screening eller PCR-screening, differentiel screening, DNA-probe De fleste kloningsvektorer bærer antibiotikaresistensgener (anti-ampicillin, tetracyclin).Når plasmidet overføres til Escherichia coli, vil bakterierne opnå resistens, og dem uden overførsel vil ikke have resistens.Men den kan ikke skelne, om den er blevet omorganiseret eller ej.I en vektor indeholdende to resistensgener, hvis et fremmed DNA-fragment indsættes i et af generne og får genet til at blive inaktiveret, kan to pladekontroller indeholdende forskellige lægemidler bruges til at screene for positive rekombinanter.For eksempel indeholder pUC-plasmidet LacZ-genet (der koder for β-galactosidase), som kan nedbryde det kromogene substrat X-gal (5-brom-4-chlor-3-indol-β-D-galactosid) for at producere blåt og dermed gøre stammen blå.Når det fremmede DNA indsættes, kan LacZ-genet ikke udtrykkes, og stammen er hvid for at screene de rekombinante bakterier.
10. Forklar den grundlæggende proces med at opnå transgene dyr gennem embryonale stamceller?
Embryonale stamceller (ES) er embryonale celler under embryonal udvikling, som kan dyrkes kunstigt og formere sig og har den funktion at differentiere til andre typer celler.Dyrkning af ES-celler: Blastocystens indre cellemasse isoleres og dyrkes.Når ES dyrkes i et foderfrit lag, vil det differentiere til forskellige funktionelle celler såsom muskelceller og N-celler.Når det dyrkes i et medium indeholdende fibroblaster, vil ES opretholde differentieringsfunktionen.ES kan manipuleres genetisk, og dets differentieringsfunktion kan integreres uden at påvirke dets differentieringsfunktion, hvilket løser problemet med tilfældig integration.Introducer eksogene gener i embryonale stamceller, implanter derefter i livmoderen på gravide hunmus, udvikler sig til unger og krydser for at opnå homozygote mus.
