1. Indledende forståelse
På dette stadium er vi nødt til at forstå nogle begreber og terminologi, for at undgå at begå fejl foran vores seniorer, såsom:
Q: Hvad er forskellen mellem RT-PCR, qPCR, Real-time PCR og real-time RT-PCR?
Svar: RT-PCR er revers transkriptions-PCR(revers transcription PCR, RT-PCR), som er en meget brugt variant af polymerasekædereaktion (PCR).I RT-PCR transkriberes en RNA-streng omvendt til komplementært DNA, som derefter bruges som skabelon til DNA-amplifikation ved PCR.
Real-time-PCR og qPCR(Quantitative Real-ltime-PCR) er det samme, begge er real-time kvantitative PCR, hvilket betyder, at hver cyklus af PCR har real-time dataposter, så antallet af startskabeloner kan justeres præcis analyse.
Selvom både Real-time PCR (real-time fluorescerende kvantitativ PCR) og Reverse transcription PCR (revers transcription PCR) synes at blive forkortet til RT-PCR, er den internationale konvention: RT-PCR refererer specifikt til revers transkriptionPCR , Real-time PCR er generelt forkortet til qPCR (kvantitativ real-time PCR).
Og real-time RT-PCR (RT-qPCR), det er omvendt transkriptions-PCR kombineret med den fluorescerende kvantitative teknologi: først opnå cDNA (RT) fra RNA revers transkription, og derefter bruge Real-time PCR til kvantitativ analyse (qPCR).De fleste laboratorier laver RT-qPCR, det vil sige forskning i RNA-ekspression nedregulering, så den qPCR, som alle taler om i laboratoriet, refererer faktisk til RT-qPCR, men glem ikke, at der stadig er mange DNA-tests i kliniske applikationer.Kvantitativ analyse, såsom påvisning af hepatitis B-virus HBV.
Spørgsmål: Efter at have læst en masse fluorescerende kvantitativ PCR, hvorfor skal det amplificerede fragment kontrolleres inden for området 80-300bp?
Svar: Længden af hver gensekvens er forskellig, nogle er flere kb, nogle er hundredvis af bp, men vi behøver kun at kræve, at produktlængden er 80-300bp, når vi designer primere, for korte eller for lange er ikke egnede til fluorescerende kvantitativ PCR-detektion.Produktfragmentet er for kort til at kunne skelnes fra primer-dimeren.Længden af primer-dimeren er omkring 30-40bp, og det er svært at skelne, om det er en primer-dimer eller et produkt, hvis det er mindre end 80bp.Hvis produktfragmentet er for langt og overstiger 300 bp, vil det let føre til lav amplifikationseffektivitet og kan ikke effektivt detektere mængden af genet.
Når du for eksempel tæller, hvor mange mennesker der er i et klasseværelse, skal du kun tælle, hvor mange munde der er.Det samme gælder, når du opdager gener, du behøver kun at detektere en bestemt sekvens af et gen for at repræsentere. Hele sekvensen vil duge.Hvis du vil tælle mennesker, skal du tælle både mund og næse, ører og briller, og det er nemt at lave fejl.
For at udvide, i biologisk forskning, er der mange forskningstilfælde fra punkt til område, fordi gensekvensen for enhver art er meget lang, det er unødvendigt og umuligt at måle alle fragmenter, såsom bakteriel 16S-sekventering, som er at udføre den konservative sekvens af bakterier Assays for at udlede antallet af en bestemt population af bakterier.
Q: Hvad er den optimale længde for qPCR primer design?
Svar: Generelt er primerlængden omkring 20-24bp, hvilket er bedre.Selvfølgelig skal vi være opmærksomme på primerens TM-værdi, når primeren designes, fordi dette er relateret til den optimale annealingstemperatur.Efter mange forsøg er det blevet bevist, at 60°C er en bedre TM-værdi.Hvis annealingstemperaturen er for lav, vil det let føre til uspecifik amplifikation.Hvis annealingstemperaturen er for høj, vil amplifikationseffektiviteten være relativt lav, toppen af amplifikationskurven starter senere, og CT-værdien vil blive forsinket.
Q: Hvordan er farvemetoden forskellig fra probemetoden?
Svar: FarvemetodeNogle fluorescerende farvestoffer, såsom SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO osv., udsender ikke lys af sig selv, men vil udsende fluorescens efter binding til den mindre rille af dobbeltstrenget DNA.Derfor kan maskinen i begyndelsen af PCR-reaktionen ikke detektere det fluorescerende signal.Når reaktionen når annealing-forlængelsestadiet, åbnes dobbeltstrengen, og en ny streng syntetiseres under påvirkning af DNA-polymerase, og det fluorescerende molekyle binder til dsDNA-minor-rillen.Efterhånden som antallet af PCR-cyklusser stiger, kombineres flere og flere farvestoffer med dobbeltstrenget DNA, og det fluorescerende signal forbedres også kontinuerligt.Farvemetoden bruges hovedsageligt i videnskabelig forskning.
PS: Vær forsigtig, når du laver eksperimentet, farvestoffet skal kombineres med menneskeligt DNA, pas på at gøre det til en fluorescerende person.
Farvemetode (venstre) Probemetode (højre)
PS: Vær forsigtig, når du laver eksperimentet, farvestoffet skal kombineres med menneskeligt DNA, pas på at gøre det til en fluorescerende person.
SYBR Grøn Ⅰ binder til den mindre rille af DNA
Probe metodeTaqman probe er den mest almindeligt anvendte hydrolysesonde.Der er en fluorescerende gruppe i 5'-enden af proben, sædvanligvis FAM, og selve proben er en sekvens komplementær til målgenet.Der er en fluorescerende quenching-gruppe i 3′-enden.I henhold til princippet om fluorescensresonansenergioverførsel (Förster resonansenergioverførsel, FRET), når reporterfluorescensgruppen (donorfluorescerende molekyle) og den slukkende fluorescerende gruppe (acceptorfluorescerende molekyle) exciteres Når spektrene overlapper og afstanden er meget tæt på (7-10 fluorescerende fluorescerende molekyle), acceptormolekylet, mens autofluorescensen er svækket.Derfor, i begyndelsen af PCR-reaktionen, når proben er fri og intakt i systemet, vil reporter-fluorescensgruppen ikke udsende fluorescens.Ved annealing binder primeren og proben til skabelonen.Under forlængelsesstadiet syntetiserer polymerasen løbende nye kæder.DNA-polymerase har 5′-3′ exonukleaseaktivitet.Når den når proben, vil DNA-polymerasen hydrolysere proben fra skabelonen, adskille reporter-fluorescerende gruppe fra quencher-fluorescerende gruppe og frigive det fluorescerende signal.Da der er et en-til-en forhold mellem proben og skabelonen, er probemetoden overlegen i forhold til farvestofmetoden med hensyn til testens nøjagtighed og følsomhed.Probemetoden bruges hovedsageligt til diagnosticering.
Q: Hvad er absolut kvantificering?Hvad er relativ kvantificering?
Svar: Absolut kvantificering refererer til beregningen af det oprindelige kopinummer af prøven, der skal testes med qPCR, såsom hvor mange HBV-vira der er i 1 ml blod.Resultatet opnået ved relativ kvantificering er ændringen i mængden af målgenet i en specifik prøve i forhold til en anden referenceprøve, og genekspressionen er op- eller nedreguleret.
Q: Vil mængden af RNA-ekstraktion, revers transkriptionseffektivitet og amplifikationseffektivitet påvirke de eksperimentelle resultater?
Spørgsmål: Vil prøveopbevaring, ekstraktionsreagenser, revers transkriptionsreagenser og lystransmitterende forbrugsstoffer påvirke de eksperimentelle resultater?
Q: Hvilken metode kan korrigere de eksperimentelle data?
Med hensyn til disse problemer vil vi beskrive dem i detaljer i de avancerede og avancerede afsnit nedenfor.
2. Avanceret viden
Med hensyn til real-time fluorescerende kvantitativ PCR, må vi erkende, at der hvert år udgives tusindvis af videnskabelige forskningsartikler, blandt hvilke den fluorescerende kvantitative PCR-teknologi ikke er et lille antal.
Hvis der ikke er nogen fælles standard til at måle det fluorescerende kvantitative PCR-eksperiment, kan resultaterne variere meget.For det samme gen af samme art, med samme behandlingsmetode, vil påvisningsresultaterne også variere meget, og det vil være svært for efternølende at gentage de samme resultater.Du Ingen ved, hvad der er rigtigt, og hvad der er forkert.
Betyder det, at fluorescerende kvantitativ PCR er en snydeteknologi eller en upålidelig teknologi?Nej, det er fordi fluorescerende kvantitativ PCR er mere følsom og mere præcis, og lidt forkert betjening vil give helt modsatte resultater.Et lille tab er tusind miles væk.Artiklens forfatter kan gentagne gange blive tortureret af anmelderne.Samtidig er tidsskriftets anmeldere også svære at vælge mellem forskellige forsøgsresultater.
Alt i alt peger det på en mangel på konsensus i real-time PCR eksperimenter.Til dette formål begyndte seniorforskere i industrien at formulere standarder,at kræve, at bidragydere angiver nogle nødvendige eksperimentelle og databehandlingsdetaljer (herunder nødvendige data) i artiklen for at opfylde disse standarder.
Korrekturlæsere kan bedømme kvaliteten af eksperimentet ved at læse disse detaljer;fremtidige læsere kan også bruge dette til at gentage eksperimentet eller forbedre eksperimentet.Så er de eksperimentelle resultater opnået på denne måde fulde af information, høj kvalitet og brugbare.
MIBBI (Minimumsinformation for biologiske og biomedicinske undersøgelser -http://www.mibbi.org) blev til.MIBBI er et projekt, der leverer standarder for eksperimenter.Den udgives i naturen.Dette projekt er rettet mod forskellige biologiske eksperimenter, herunder cellebiologi, Microarray, qPCR, vi skal diskutere nu osv., og sørger for hver type eksperiment ved indsendelse af manuskripter.Disse oplysninger skal gives til enhver tid.
I MIBBI-projektet er der to artikler relateret til fluorescerende kvantitativ PCR, nemlig:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – en struktureret sprog- og rapporteringsvejledning til kvantitative PCR-data i realtid;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – minimumsinformation til publicering af artikler om kvantitative PCR-eksperimenter i realtid.
Lad os først tale om RDML, terminologispecifikationen.
Hvis der ikke er en standarddefinition for alt, er det umuligt at fortsætte diskussionen, hvorfor begrebsforklaringen er så vigtig i eksamen.
Den anvendte terminologi i det fluorescerende kvantitative PCR-eksperiment inkluderer følgende indhold.QIAGEN har lavet den bedste oversigt til os.Følgende er alle tørregods .
Amplifikationskurve
Amplifikationskurven refererer til kurven lavet under PCR-processen med cyklusnummeret som abscissen og realtidsfluorescensintensiteten under reaktionen som ordinaten.
En fremragende amplifikationskurve bør have følgende egenskaber: basislinjen er flad eller let formindsket, og der er ingen tydelig opadgående tendens;kurvens bøjningspunkt er klart, og hældningen af den eksponentielle fase er proportional med amplifikationseffektiviteten.Jo større hældning, jo højere forstærkningseffektivitet;den overordnede amplifikationskurve. Parallellen er god, hvilket indikerer, at forstærkningseffektiviteten af hvert rør er ens;den eksponentielle fase af amplifikationskurven for prøver med lav koncentration er indlysende.
Baseline (Baseline)
Basislinjen er støjniveauet for den tidlige cyklus, normalt målt mellem 3. og 15. cyklus, fordi stigningen i fluorescensværdien forårsaget af amplifikationsproduktet ikke kan påvises i denne periode.Antallet af cyklusser, der bruges til at beregne basislinjen, kan varieres og skal muligvis reduceres, hvis der anvendes høje skabelonmængder, eller hvis ekspressionsniveauet af målgenet er højt.
Indstilling af basislinjen kræver visning af fluorescensdata fra linearitetsforstærkningskurven.Basislinjen er indstillet således, at væksten af amplifikationskurven begynder med et cyklusnummer, der er større end basislinjens cyklus topnummer.Basislinjer skal indstilles individuelt for hver målsekvens.De gennemsnitlige fluorescensværdier påvist i de tidlige cyklusser skal trækkes fra fluorescensværdierne opnået i de amplificerede produkter.De seneste versioner af forskellige Real-Time PCR-software tillader automatisk optimering af baseline-indstillinger for individuelle prøver.
Under de første par cyklusser af PCR-amplifikationsreaktionen ændres fluorescenssignalet ikke meget.At nærme sig en lige linje kaldes basislinjen, men hvis vi ser nærmere på de første par cyklusser, ser vi, at inden for basislinjen er det, der sker på billedet nedenfor.
Baggrund Baggrund refererer til
den uspecifikke fluorescensværdi i reaktionen.For eksempel: ineffektiv fluorescensslukning;eller et stort antal dobbeltstrengede DNA-skabeloner på grund af brugen af SYBR Green.Baggrundskomponenterne af signalet fjernes matematisk af Real-Time PCR-softwarealgoritmen.
Reporter signal
Reportersignal refererer til det fluorescerende signal genereret af SYBR Green eller fluorescensmærkede sekvensspecifikke prober under realtids-PCR.
Normaliseret reportersignal (RN)
RN refererer til fluorescensintensiteten af reporterfarvestoffet divideret med fluorescensintensiteten af det passive referencefarvestof målt ved hver cyklus.
Passiv referencefarve
I nogle realtids-PCR'er,det fluorescerende farvestof ROX bruges som en intern reference til at normalisere det fluorescerende signal.Den korrigerer for variationer på grund af unøjagtig pipettering, brøndposition og fluorescensudsving på brønd for brønd.
Fluorescenstærsklen (tærskel)
blev justeret over baggrundsværdien og signifikant under plateauværdien af amplifikationskurven.Det skal ligge i det lineære område af amplifikationskurven, hvilket repræsenterer det log-lineære område for PCR-detektion.Tærskler bør indstilles i log-amplifikationskurvevisningen, så den log-lineære fase af PCR let kan identificeres.Hvis der er flere målgener i Real-Time PCR, skal tærsklen indstilles for hvert mål.Generelt bruges fluorescenssignalet for de første 15 cyklusser af PCR-reaktion som fluorescensbaggrundssignalet, og fluorescenstærsklen er 10 gange standardafvigelsen af fluorescenssignalet for de første 3 til 15 PCR-cyklusser, og fluorescenstærsklen indstilles i den eksponentielle PCR-amplifikationsfase.Generelt har hvert instrument sin fluorescenstærskel indstillet før brug.
Cycle Threshold (CT) eller Crossing Point (CP)
Den cyklus, hvor amplifikationskurven krydser tærsklen (dvs. det punkt, hvor fluorescensdetektion stiger signifikant).CT kan være en brøkdel, og mængden af startskabelon kan beregnes.CT-værdien repræsenterer antallet af cyklusser, der opleves, når det fluorescerende signal i hvert PCR-reaktionsrør når den indstillede tærskel.Der er et lineært forhold mellem CT-værdien for hver skabelon og logaritmen af skabelonens oprindelige kopinummer,højere det oprindelige kopinummer, jo mindre er CT-værdien og omvendt.En standardkurve kan laves ved at anvende en standard med kendt startkopital, hvor abscissen repræsenterer CT-værdien, og ordinaten repræsenterer logaritmen af det initiale kopital.Så længe CT-værdien af den ukendte prøve er opnået, kan det oprindelige kopinummer for prøven derfor beregnes ud fra standardkurven.
ΔCT værdi
ΔCT værdi beskriverforskellen mellem målgenet og den tilsvarende endogene referencegen CT-værdi, såsom et husholdningsgen, og bruges til at normalisere mængden af anvendt skabelon:
⇒ΔCT = CT (målgen) – CT (endogent referencegen)
ΔΔCT værdi
ΔΔCT-værdien beskriver forskellen mellem den gennemsnitlige ΔΔCT-værdi for en prøve af interesse (f.eks. stimulerede celler) og den gennemsnitlige ΔΔCT-værdi for en referenceprøve (f.eks. ustimulerede celler).Referenceprøven kaldes også kalibreringsprøven, og alle andre prøver er normaliseret til denne for relativ kvantificering:
⇒ΔΔCT = gennemsnitlig ΔCT (prøve af interesse) – gennemsnitlig ΔCT (referenceprøve)
Endogene referencegener (endogene referencegener)
Ekspressionsniveauerne for endogene referencegener, såsom husholdningsgener (husholdningsgener), adskiller sig ikke mellem prøver.Sammenligning af CT-værdierne for referencegenet med målgenet gør det muligt at normalisere ekspressionsniveauet af målgenet til mængden af input-RNA eller cDNA (se afsnittet om ΔCT-værdier ovenfor).
Interne referencegener korrigerer formulig RNA-nedbrydning eller tilstedeværelsen af enzymhæmmere i RNA-prøver, såvel som variationer i RNA-indhold, revers transkriptionseffektivitet, nukleinsyregenvinding og prøvehåndtering.For at vælge de(t) optimale referencegen(er), modificerede vi algoritmen for at tillade dens valg af den optimale reference afhængig af den eksperimentelle indstilling.
Intern kontrol
En kontrolsekvens, der amplificeres i samme reaktion som målsekvensen og probes med en anden probe (dvs. udfører duplex PCR).Interne kontroller bruges ofte til at udelukke mislykkede amplifikationer, såsom når målsekvensen ikke detekteres.
Kalibreringsprøve
En referenceprøve (f.eks. oprenset RNA fra en cellelinje eller væv), der anvendes i relativ kvantificering til at sammenligne alle andre prøver for at bestemme det relative ekspressionsniveau af et gen.Kalibreringsprøven kan være en hvilken som helst prøve, men er sædvanligvis en kontrol (for eksempel en ubehandlet prøve eller en prøve fra tidspunktet nul af eksperimentet).
Positive kontroller
bruge kontrolreaktioner medkendte mængder skabelon.Positive kontroller bruges ofte til at kontrollere, at et primersæt eller primer-probe-sæt fungerer korrekt, og at reaktionen er indstillet korrekt.
Ingen skabelonkontrol (NTC)
En kontrolreaktion, der indeholder alle de nødvendige komponenter i amplifikationsreaktionen undtagen skabelonen, som normalt erstattes med vand.Brugen af NTC kan finde kontamineringen forårsaget af reagenskontamination eller fremmed DNA, og dermed sikre ægtheden og pålideligheden af detektionsdataene.Amplifikation af NTC-kontrollen indikerer kontaminering.
Ingen RT kontrol (NRT)
RNA-ekstraktionsproces kan indeholde resterende genomisk DNA, som er ekstremt skadeligt og er synderen, der påvirker datakvaliteten og den naturlige fjende af qPCR, så når man designer eksperimenter, skal den designes til kun at amplificere RNA-detektion.Der er to måder, den ene er at designe primere på tværs af introner, den anden er at fjerne DNA fuldstændigt, hvilken er bedre, hvilket vil blive diskuteret senere.NTR-kontrollen er et magisk spejl til at detektere DNA-forurening.Hvis der er forstærkning, betyder det, at der er forurening.
Standarder
Standarder er prøver med kendt koncentration eller kopiantal, der bruges til at konstruere en standardkurve.For at sikre standardens stabilitet klones genfragmentet sædvanligvis ind i plasmidet og anvendes som standard.
Standardkurven
fortyndes normalt i mindst 5 koncentrationsgradienter med standardproduktet i henhold til fordoblingsforholdet, og der tegnes 5 punkter i koordinaterne for CT-værdi og kopital, og punkterne forbindes til at danne en linje for at generere en standardkurve.For hver standardkurve skal dens gyldighed kontrolleres.Hældningsværdien falder mellem –3,3 og –3,8, og hver koncentration udføres i tre eksemplarer.Punkter, der er væsentligt forskellige fra andre punkter, bør kasseres.CT-værdien af prøven, der skal testes, bringes ind i standardkurven, og ekspressionsniveauet for prøven, der skal testes, kan beregnes.
CT-værdien af prøven, der skal testes, bringes ind i standardkurven, og det oprindelige kopinummer for prøven, der skal testes, kan beregnes.
Effektivitet og hældning
Hældningen af standardkurven repræsenterer effektiviteten af real-time PCR.
·En hældning på -3,322 indikerer, at PCR-amplifikationseffektiviteten er 1 eller 100 % effektiv, og mængden af PCR-produkt fordobles ved hver cyklus.
·En hældning mindre end –3,322 (f.eks. –3,8) indikerer en PCR-effektivitet
·En hældning større end -3,322 (f.eks. -3,0) indikerer, at PCR-effektiviteten ser ud til at være større end 100%, hvilket er nysgerrigt, hvordan kunne en PCR-cyklus generere mere end det dobbelte af det amplificerede produkt?Denne situation opstår i den ikke-lineære fase af PCR-reaktionen, det vil sige, at der er en stor mængde ikke-specifik amplifikation.
smeltekurve
Efter at qPCR-amplifikationen er afsluttet, opvarmes PCR-produktet.Når temperaturen stiger, smelter det dobbeltstrengede amplifikationsprodukt gradvist, hvilket resulterer i et fald i fluorescensintensiteten.Når en vis temperatur (Tm) nås, vil et stort antal produkter smelte.Fluorescens falder kraftigt.Forskellige PCR-produkter har forskellige Tm-værdier og forskellige smeltetemperaturer, således at specificiteten af PCR kan identificeres.
Smeltekurve (afledt kurve)
Smeltekurven er afledt for at danne et topkort, som mere intuitivt kan vise situationen for PCR-produktfragmenter.Da smeltetemperaturen er Tm-værdien af DNA-fragmentet, kan nogle parametre, der påvirker Tm-værdien af DNA-fragmentet, bedømmes, såsom fragmentstørrelse, GC-indhold osv. Generelt set, i henhold til vores primerdesignprincipper,længden af det amplificerede produkt er i området 80-300 bp, så smeltetemperaturen bør være mellem 80°C og 90°C.
Fortolkning af smeltekurven: Hvis den eneste hovedtop forekommer mellem 80°C-90°C, betyder det, at den fluorescerende kvantitative PCR er perfekt;hvis hovedtoppen forekommer mellem 80°C-90°C og diverse toppe vises under 80°C, overvejes primer-dimeren grundlæggende.Du kan prøve at øge udglødningstemperaturen for at løse det;hvis hovedtoppen viser sig mellem 80°C-90°C, og den øvrige top optræder igen, når temperaturen stiger, anses det som udgangspunkt for, at der er DNA-kontamination, og DNA skal fjernes i den indledende fase af forsøget.
Selvfølgelig er der stadig nogle unormale situationer, som vil blive opdelt en efter en nedenfor.
3. Avanceret viden
For at lave qPCR må jeg sige MIQE,Minimum informationtil udgivelse afKvantitativRealtids PCREksperimenter — minimumsinformationen for publicering af artikler om kvantitativ PCR i realtideksperimenter .For at forenkle alles forståelse, vil vi forenkle det centrale indhold.
Du kan søge i den originale tekst af MIQE på internettet, og det vigtigste er, at den fastlæggerdatatjekliste, der skal oplyses ved publicering af en artikel .
Korrekturlæsere kan bedømme kvaliteten af eksperimentet ved at læse disse detaljer;fremtidige læsere kan også bruge dette til at gentage eller forbedre eksperimentet.
Det er værd at bemærke, at i denne liste er vigtigheden af hver liste markeret med henholdsvis E eller D.Hvad betyder det?E: væsentlige oplysninger (skal indsendes);D: ønskelig information (giv så meget som muligt).
MIQE (1)—Eksperimentelt design
Mange skurke, der har afsluttet deres forsvar efter at have afsluttet deres kandidatstudier, vil ikke vide, hvordan de skal designe et eksperiment uafhængigt, åbne deres notesbøger og gøre, hvad læreren beder dem om.Det resulterede i, at det eksperimentelle design ikke var stringent, og bladets redaktion sagde, at de ville lave dette billede og det billede, så de gjorde det i en døs.Sådan er skumperne lavet!
Tættere på hjemmet er det første princip i eksperimentet at bestemmestrengheden i den eksperimentelle logik.Det mest fundamentale er det eksperimentelle design, og det vigtigste ved det eksperimentelle design er, hvordan man indstiller målprøven, referenceprøven (kontrol) og antallet af gentagelser, så de eksperimentelle data kan refereres, sammenlignes og overbevisende.
Målprøvenrefererer til prøven, der kræver, at vi opdager målgenet efter en bestemt behandling.Referenceprøvener prøven uden nogen behandling, som ofte omtales som vildtype i biologien.
Eksperimentelle gentagelserer meget vigtige.Generelt skal antallet af overbevisende gentagelser være mere end tre.Det er nødvendigt at skelne mellem, hvad der er biologisk replikation, og hvad der er teknisk replikation.
Biologiske replikater: Det samme verifikationseksperiment udført med forskellige materialer (tid, planter, batches, reaktionsplader).
Biologisk duplikation
Lad os tage pesticidbehandlingen af peber som et eksempel.Vi vil sprøjte pesticider på de tre planter af ABC, så er de tre planter af ABC tre biologiske replikater, og de er det samme verifikationsforsøg udført med forskellige materialer.Men som et eksperiment er der absolut brug for en kontrol, så vi kan sprøjte en af grenene af plante A for at danne en forsøgsgruppe af plante A, og ikke sprøjte de andre grene af plante A for at danne en kontrolgruppe.Gør det samme for B og C.
Tekniske replikater (tekniske replikater): Det er et gentaget eksperiment designet til at undgå fejl forårsaget af betjening, som faktisk er et duplikathul inkluderet i det samme materiale.Både behandlinger og kontroller skal have replikatindstillinger (minimum tre) af målgenet og det interne referencegen.
Teknisk gentagelse
Tag peberen behandlet med pesticider som eksempel igen.For den eksperimentelle gruppe af plante A lavede vi tre PCR-huller på 1, 2 og 3 for henholdsvis dets målgen og interne referencegen for at tage gennemsnittet efter påvisningen.Til kontrol af anlæg A behandles grupper også på samme måde.Gør på samme måde den samme behandling for B- og C-planter.Dette er teknisk gentagelse.
Det er værd at bemærkedet, der kommer ind i statistikken, er den biologiske gentagelse, og den tekniske gentagelse er at teste, om der er tilfældige fænomener i forsøgsprocessen, for at gøre forsøgsresultaterne troværdige, altså undgå fejl ved at tage deres gennemsnit, som vi ofte siger.
Negative kontroller – NTC og NRT
NTC (No-Template Control), en kontrol uden skabelon, bruges til at verificere, om forsøgsmaterialet er kontamineret.Generelt bruges vand som skabelon.Hvis der er en fluorescerende reaktion, indikerer det, at der er sket en nukleinsyrekontamination i laboratoriet.
Disse forureninger kommer fra: urent vand, ukvalificerede reagenser indeholdende endogent DNA, primerforurening, laboratorieudstyrsforurening, aerosolforurening osv., skal bruge RNase-rensemidler og RNase-hæmmere.Aerosolforurening er den sværeste at finde.Forestil dig, at dit laboratorium er som smog, med forskellige nukleinsyrer suspenderet i luften.
NRT (No-Reverse Transcriptase)kontrollen uden revers transkription, er det ikke-revers transskriberede RNA som en negativ kontrol, som er kontrollen af gDNA-rest.
Når man laver genekspression, detekteres mængden af RNA ved at detektere mængden af cDNA efter revers transkription.Hvis der er gDNA-rest, når RNA renses, vil det forårsage fejl i forsøgsresultaterne, fordi de faktisk opnåede resultater er gDNA og cDNA.På det samlede niveau, ikke kun cDNA, skal gDNA fjernes fuldstændigt under RNA-ekstraktion.
MIQE (2)—prøveinformation
Den såkaldte prøveinformation betyder, at når vi udgiver en artikel om qPCR, skal vi forklare prøveinformationen tydeligt, hvilket er en uundværlig del af artiklen.På samme måde, når vi behandler prøver, skal vi også regulere vores egen drift for at sikre validiteten af prøverne.
Beskrivelsen af prøven er kun et resultat, og vi bør være mere opmærksomme på de materialer, der er taget under hele eksperimentet.
Udvælgelse af eksperimentelle materialer
Blodprøver – vælg frisk blod, ikke mere end 4 timer.Celleprøver – vælg at indsamle friske celler i en periode med kraftig vækst.Dyrevæv—Vælg friskt, kraftigt voksende væv.Plantevæv – Vælg frisk, ungt væv.
Du må have bemærket, at der er et nøgleord i disse få sætninger: frisk .
Til ovenstående prøver er det bedste, omkostningseffektive og stabile kit på markedet Foregenes kit, som hurtigt og nemt kan udvinde deres DNA og RNA.
Animal Total RNA Isolation Kit
Plant Total RNA Isolation Kit Plus
Opbevaring af eksperimentelle materialer
Generelt anbefaler vi ikke at opbevare prøver, hvis forholdene tillader det.Der er dog mange venner, der ikke kan udføre eksperimenter umiddelbart efter prøveudtagning, og nogle har endda behov for at transportere flydende nitrogentanke til marken for prøveudtagning.
Til denne form for hårdtarbejdende ven kan jeg kun sige, at du ikke forstår reagensforbrugsvarer.Nu producerer mange reagensforbrugende virksomheder reagenser, der kan opbevare RNA-prøver ved stuetemperatur, og du kan vælge at bruge dem.Den konventionelle opbevaringsmetode er lagring af flydende nitrogen, ved hjælp af en lille flydende nitrogentank, der er nem at bære.Efter at have bragt prøven tilbage til laboratoriet, opbevares den i et -80°C køleskab.
For eksperimenter, der involverer RNA, skal seks-ords princippet følges:lav temperatur, ingen enzymer,oghurtig .
Begrebet lav temperatur er let at forstå;uden enzymer er RNase overalt i den verden vi lever i (ellers ville du være blevet dræbt af HIV), så hvordan man undgår RNase når man laver eksperimenter er et meget vigtigt koncept;hurtig,Der er ingen Kung Fu i verden, der ikke kan brydes, kun hastighed kan ikke brydes.
Derfor, i en vis forstand, jo kortere ekstraktionstid, jo bedre er sættet.Hvorfor gørForegene's kit understreger hastighed, fordi de ved det godt.
PS: Nogle piger laver eksperimenter meget omhyggeligt, men de er ikke så gode som en slam dunk efter flere års arbejde.De føler, at Gud er uretfærdig, klager over andre og leder efter livet.Faktisk forstod hun det ikke.Han beskyttede ikke RNA'et godt, og slam dunk-spilleren var kvik.Da han lavede eksperimentet, troede han, at han ville afslutte slam dunk med tre gange, fem gange og to delinger, men han klarede eksperimentet godt.
Bemærk: Langsommere, større chancer for RNase-invasion.Hvordan træner du dig selv til at være hurtig?Der er ingen måde, bare øv dig mere.
For forskellige eksperimenter og forskellige prøver er det stadig nødvendigt at læse mere litteratur og vælge en passende metode til behandling.Til prøveindsamling og opbevaringsprocessen kræver MIQE, at det skal være tydeligt skrevet i papiret, så anmelderne kan gennemgå papirets pålidelighed, og det er også praktisk for de lamslåede unge at gentage dit eksperiment.
Selvom biologiske eksperimenter er vanskelige, er de avancerede.Hvis du ikke passer på, kan du vælte verden.For eksempel at gøre SARS til en biokemisk krise eller lave hybridris for at redde 1,3 milliarder mennesker.Billedet nedenfor er et kemisk eksperiment, du burde forstå hvor stolt du er af din forskning bare ved at se på hans pik-lignende udseende.Glem det, sort ham ikke.
MIQE (3) – nukleinsyreekstraktion.
Nukleinsyreekstraktion er en stor begivenhed, og alle molekylærbiologiske eksperimenter starter med nukleinsyreekstraktion.Lad os først og fremmest kopiere MIQE's indhold om nukleinsyreekstraktion.
Ser man på denne form, kan du ikke blive på overfladen.Formen er et dogme.For at være topelev skal du spørge hvorfor.Det væsentlige indhold i denne tabel er: Fortsætrenheden, integriteten, konsistensen og ekstraktionsmængden af RNA .
Den første del afproces eller instrument er nukleinsyreekstraktionstrinnet.Hvis du bruger en automatisk nukleinsyreekstraktor til at ekstrahere (avanceret, kontakt mig venligst for køb), skal du angive instrumentets modelnavn.
Navnet på sættet og
hvilket sæt der blev brugt til ændringsdetaljerne, hvilke specielle reagenser der blev tilføjet eller hvilke specielle operationer der blev udført, skal forklares tydeligt, så andre nemt kan gentage dit eksperiment.
Nogle mennesker tilføjer nogle specielle reagenser, når de uddrager specielle prøver, og tror, at dette er deres hemmelige våben, og fortæller det ikke til andre.Mens de holder det hemmeligt, mister de også muligheden for at få din artikel til at skinne.Vær ikke klog, du skal være mere ærlig end den gamle Zhang i videnskabelig forskning, hvis du vil være klog, vil artiklen gøre dig dum.
skal huske sættets produktnummernår du bestiller sættet og skriver artiklen.Der er generelt to numre på sættet: Kat – katalognummer (produktnummer, artikelnummer), Lot – produktlotnummer (bruges til at angive, hvilken batch produktet kom fra).
Derudover bruges CAS-nummeret ofte ved bestilling af biokemiske reagenser, og jeg vil popularisere det sammen.CAS-nummeret er det nummer, som American Chemical Society giver til hvert nyt kemisk lægemiddel.Generelt er tre tal forbundet med en bindestreg.Rushuis CAS-nummer: 7732-18-5.Kemikalier har ofte flere aliaser, men CAS-nummeret er unikt.Ved bestilling af medicin kan du først tjekke dets CAS-nummer.
Tættere på hjemmet, hvorfor skal vi beskrive disse ting klart?Faktisk er det også for at kontrollere kvaliteten af RNA-ekstraktion.Brugen af instrumenter og kits vil gøre RNA-ekstraktion mere konsekvent.Ekstraktionsskalaen i almindelige laboratorier er ikke stor, og den kan fås med sæt.
Detaljerne om DNase- eller RNase-behandling
Det vigtige spørgsmål om fluorescerende kvantitativ PCR er at forhindre DNA-kontamination, og eksperimenter ikke, hvis der er kontaminering.Derfor er det bydende nødvendigt at angive den proces, du brugte til at behandle DNA'et, for at påvise, at DNA'et i den eksperimentelle proces er blevet fuldstændigt og fuldstændigt fjernet.repræsenteret ved et skematisk diagram.
Skematisk diagram af RNA og DNA
Generelt er metoden til fjernelse af DNA at behandle RNA med DNase efter ekstraktion.Det er dog relativt gamle metoder.Kommercielle RNA-ekstraktionssæt har været i stand til at fjerne DNA under ekstraktionsprocessen uden at tilføje DNase.For eksempel en serie kits fra Foregene.
Bemærk: Fjernelse af DNA under RNA-ekstraktion er et meget farligt tveægget sværd, som vil forlænge operationstiden for RNA-ekstraktion og øge risikoen for RNA-nedbrydning.Dybest set er det en afvejning mellem RNA-udbytte og renhed.
Derudover er mængden af DNase tilsat til den silica-baserede adsorptionskolonne meget lille, og der skal bruges DNase af høj kvalitet for at opnå effekten.Uoptimeret DNase kan ikke fordøjes hurtigt og fuldstændigt.Dette er en test af forretningens tekniske niveau.Selvfølgelig er der endnu flere underlige købmænd, der praler af, at DNA kan fjernes uden DNase.Man kan sige, at enhver, der praler med, at DNA kan fjernes fuldstændigt uden DNase, er en hooligan.DNA er en forholdsvis stabil dobbeltstrenget struktur, og den kan ikke udslettes bare ved at tale og grine.
Forureningsvurdering
vurderingsmetode: elektroforesedetektion, 1% agarose, 6V/cm, 15min, belastning 1-3 ul
Nukleinsyre kvantitativ analyse
måles normalt ved hjælp af et UV-spektrofotometer.Lad mig først popularisere betydningen af de tre værdier af OD260, OD280 og OD230.
·OD260nm: Det er absorptionsbølgelængden af den højeste absorptionstop af nukleinsyre, og den bedst målte værdi går fra 0,1 til 1,0.Hvis ikke, fortynd eller koncentrer prøven for at bringe den inden for rækkevidde.
·OD280nm: Det er absorptionsbølgelængden for den højeste absorptionstop af protein og phenoliske stoffer.
·OD230nm: Det er absorptionsbølgelængden af kulhydraternes højeste absorptionstop.
Lad os derefter tale om hver indikators rolle.For A260 kan den bruges til at måle udbyttet af nukleinsyre.Når OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
For renhed skal vi se på de forhold, som vi almindeligvis ser: OD260/280 og OD260/230.
·Rent DNA: OD260/280 er omtrent lig med 1,8.Når det er større end 1,9, indikerer det, at der er RNA-forurening, og når det er mindre end 1,6, indikerer det, at der er protein- og phenolforurening.
·Rent RNA: 1,7
·OD260/230: Uanset om det er DNA eller RNA, er referenceværdien 2,5.Når den er mindre end 2,0, indikerer det, at der er forurening af sukker, salt og organisk stof.
RNA integritet
Det er meget vigtigt at måle integriteten af RNA.Generelt er det nødvendigt at lave et RNA-denatureringsgeleksperiment for at kontrollere, om lysstyrken mellem 28S og 18S RNA er et dobbelt forhold.Når det tredje bånd 5S vises, betyder det, at RNA'et er begyndt at nedbrydes, bortset fra hvirvelløse dyr.
Data til RNA-kvalitetsvurdering: Udover ovenstående tests findes der også nogle mere avancerede instrumenttest med hensyn til RNA-integritet, såsom RQI-integritetstesten af Experion automatiske elektroforesesystem, som kan detektere om RNA nedbrydes usynligt.
I videnskabelig forskning er fluorescerende kvantitativ PCR en sammenligning mellem målgenet og det interne referencegen.Derfor er det primære mål i processen med RNA-prøvekonservering, RNA-ekstraktion osv. at sikre RNA's integritet.
Hvordan integriteten af RNA påvirker balancen mellem målgenet og det interne referencegen kan let forstås ud fra nedenstående figur.Nedbrydning vil føre til genet ufuldstændighed, uanset om det er ufuldstændigheden af det interne referencegen eller ufuldstændigheden af målgenet, vil det have stor indflydelse på dataene.
Skematisk diagram af målgen og referencegen må ikke være sandt
Hæmningstest (om CT-værdien er undertrykt under høj eller lav koncentration eller andre forhold)
Tager man denne figur som et eksempel, er Ct-værdierne for de fem kurver som følger.Fordelingen af CT-værdier mellem kurverne er ujævn, og Ct-værdierne er forsinket under høje og lave koncentrationer, hvilket er tilfældet med PCR-hæmning.
Nøglepunkt: I processen med RNA-ekstraktion er vi nødt til at opgive misforståelser og etablere korrekte.
Den forkerte idé er: RNA-ekstraktion forfølger kun udbyttet, idet man tænker, at jo større mængde RNA opnået, jo bedre.Faktisk, når vi kvantificerer, hvis antallet af gener ikke er særlig stort, har vi ikke brug for meget RNA.Mængden af RNA du udvinder er mere end nok.
Det rigtige koncept er:RNA-ekstraktion bør forfølge renhed, integritet og konsistens.Renhed kan sikre, at den efterfølgende reverse transkription ikke hæmmes, og dataene vil ikke blive påvirket af DNA.Integritet sikrer balancen mellem målsekvenser og interne referencer.Konsistens sikrer stabil prøvebelastning.
MIQE (4) – omvendt transkription
Misforståelse: jagten på højere prøvevolumen.
Korrekt koncept: Søg konsistens (stabilitet), uanset mængden af ladet RNA forbliver effektiviteten af revers transkription konsistent, hvilket sikrer, at forskelle i cDNA virkelig kan afspejle forskelle i mRNA.
Vi forklarer denne proces med et skematisk diagram:
Skematisk diagram af omvendt transskriptionseffektivitet, er ikke sandt
Først og fremmest skal vi forstå forskellen mellem omvendt transkriptionsprocessen og PCR-processen.PCR gennemgår flere opvarmnings- og annealingsprocesser, og målfragmentet vokser eksponentielt;mens omvendt transkription ikke har denne proces, kan vi forestille os, at omvendt transkription faktisk er en-til-en Under replikationsprocessen, så mange stykker af RNA
som der er kan få så mange stykker af cDNA Information, bør det være forstået nu, fordi fragmenter store og små er blevet omvendt transskriberet, og det er umuligt at fokusere på ét fragment.Og fordi mængden af RNA er relativt lille, er mængden af opnået cDNA også relativt lille, i modsætning til PCR, som har en amplifikationseffekt, så det er stort set umuligt at opdage.
cDNA elektroforese resultater
For det andet udføres revers transkription ideelt set en-til-en, men ingen revers transkriptase fra nogen virksomhed kan opnå denne effekt.Dybest set vandrer effektiviteten af de fleste reverse transkriptaser mellem 30-50%.Hvis dette er tilfældet, vil vi hellere have en relativt stabil revers transkriptionseffektivitet, hvilket er det, vi ønsker at se på figuren: 3 RNA'er får 2 cDNA'er, 6 RNA'er får 4 cDNA'er, så uanset hvor meget prøve der er indlæst, er revers transkriptionseffektiviteten relativt stabil.Vi ønsker ikke at se den situation, hvor revers transkriptionseffektivitet er ustabil og høj koncentration hæmmes.
Så hvordan kan man verificere, om den omvendte transkriptionseffektivitet er stabil?Metoden er meget enkel, du behøver kun at lave en sammenligningstest: den ene er at omvendt transskribere til cDNA efter fordobling af fortynding af RNA, og den anden er at lave fordobling fortynding efter omvendt transskribering til cDNA, og derefter udføre qPCR for at se den opnåede hældning Er den konsistent.Som topelev bør du forstå det på få sekunder.Som vist nedenfor:
Fortynding af RNA og cDNA for at teste, om effektiviteten af revers transkription er stabil
Revers transkriptase og kit
Hvordan kan perfekt fluorescerende kvantitativ PCR have fremragende revers transkriptase og kit.Revers transkriptase er groft opdelt i to typer efter kilden, AMV ellerM-MLV, og deres ydeevne er den samme som vist i tabellen.
RNase H aktivitet
RNase H er Ribonuclease H, det kinesiske navn er ribonuclease H, som er en endoribonuclease, der specifikt kan hydrolysere RNA i DNA-RNA-hybridkæden.RNase H kan ikke hydrolysere phosphodiesterbindingerne i enkeltstrenget eller dobbeltstrenget DNA eller RNA, det vil sige, det kan ikke fordøje enkeltstrenget eller dobbeltstrenget DNA eller RNA.Almindeligvis brugt i syntesen af den anden streng af cDNA.
Det er en mærkelig ting.Vi siger, at revers transkriptase har RNase H-aktivitet, ikke at revers transkriptase indeholder RNase H, og det er muligvis ikke muligt at adskille RNase H fra revers transkriptase, måske på grund af konformationen af visse grupper i revers transkriptase. Denne aktivitet er forårsaget af revers transkriptase.
Derfor, uanset den højere revers transkriptionseffektivitet af AMV, reducerer dens RNase H-aktivitet udbyttet af cDNA.Selvfølgelig optimerer reagensproducenter konstant deres produkter for at eliminere RNase H-aktivitet i revers transkriptase så meget som muligt for at øge udbyttet af cDNA.
Udglødningstemperatur
Sekundær struktur af RNA ved forskellige temperaturer
Se figuren ovenfor for den sekundære struktur af RNA ved forskellige temperaturer, og brug mFold online-værktøjet til at bestemme den sekundære struktur af målfragmentet under specifikke temperatur- og saltkoncentrationsbetingelser.Ved 55°C er den sekundære struktur af RNA'et stadig meget kompleks, revers transkriptase kan ikke fungere, og den sekundære struktur kan ikke opløses fuldstændigt før 65°C, mens den optimale temperatur for AMV og M-MLV er langt lavere end denne temperatur.
hvad skal man gøre?Den sekundære struktur er den komplementære parring af selve skabelonen, hvilket fører til stærk konkurrence mellem primeren og revers transkriptase og skabelonen, hvilket resulterer i en række problemer såsom lav E og dårlig repeterbarhed.
hvad skal man gøre?Øg kun udglødningstemperaturen så meget som muligt.
Mange reagensproducenter forbedrer deres reverse transkriptase gennem genteknologi.Nogle øger reaktionstemperaturen, såsom Jifan og Aidelai, og nogle fjerner den aktive gruppe af RNase H-enzym for at forbedre affiniteten mellem enzymet og RNA-skabelonen.Høj affinitet kan konkurrencedygtigt presse den sekundære struktur ud og læse jævnt igennem og også i høj grad forbedre effektiviteten af omvendt transskription.
Nøglepunkt: Revers transkription er vigtigere for at forfølge konsistensen af revers transkriptionseffektivitet (enzymer skal ikke kun være effektive, men også stabile), frem for mængden af prøve, der lades, hvis det ikke er en særlig storskala fluorescerende kvantitativ PCR, vil det slet ikke være muligt.Flere cDNA'er.
Forskellige producenter har også gjort nogle anstrengelser i stræben efter konsistens.For eksempel har de fleste virksomheder nu pakket omvendt transskription som et standardsæt til salg, hvilket er et godt valg.
For eksempel Foregenes RT Easy Series-sæt:
RT Easy I (Master premix til første streng cDNA syntese kit)
MIQE (5) – målgeninformation
Ovenstående figur forklarer
1. Hvorvidt dette gen er effektivt til gentagne forsøg, kan generelt verificeres ved gentagne forsøg.
2. Gen-ID, du ved.
3. Genlængde, den samlede længde af målgenet er bestemt ikke noget problem.Når du designer primere, skal du sikre dig, at længden af amplikonet er mellem 80-200bp for at sikre en bedre amplifikationseffektivitet.
4. Sekvens Blast-sammenligningsinformation, målgenet skal sammenlignes i genbank for at forhindre uspecifik amplifikation.
5. Tilstedeværelse af pseudogener.Et pseudogen er en DNA-sekvens, der ligner et normalt gen, men mister sin normale funktion.Det eksisterer ofte i multi-genfamilien af eukaryoter.Det er normalt repræsenteret ved ψ.Det er en ikke-funktionel genomisk DNA-kopi i genomet, der minder meget om den kodende gensekvens., er generelt ikke transskriberet og har ingen klar fysiologisk betydning.
6. Placering af primere i forhold til exoner og introner.I de tidlige år, da vi løste problemet med DNA-kontamination, var vi ofte opmærksomme på positionerne af primere, exoner og introner og overvejede generelt at designe primere på tværs af introner for at undgå DNA-amplifikation.Se venligst figuren nedenfor: sort repræsenterer introner, forskellige blå farver repræsenterer exoner, pink repræsenterer almindelige primere, og lys rød repræsenterer intronspændende primere.
Skematisk, aldrig sandt
Hvilken perfekt plan synes dette, men i de fleste tilfælde er trans-intron-primerne ikke så magiske som forestillet, og de vil også forårsage uspecifik amplifikation.Så den bedste måde at forhindre DNA-kontamination på er at fjerne DNA fuldstændigt.
7. Konformationsforudsigelse.Brug dette eksempel igen, brug mFold-onlineværktøjet til at bestemme den sekundære struktur af målfragmentet ved en specifik temperatur og saltkoncentration.
Sekundær struktur af RNA ved forskellige temperaturer
Den sekundære struktur er den komplementære parring af selve skabelonen, hvilket vil føre til stærk konkurrence mellem primeren og skabelonparringen, og chancerne for primerbinding er mindre, hvilket resulterer i en række problemer såsom lav E og dårlig repeterbarhed.Gennem softwareforudsigelse, hvis der ikke er noget sekundært strukturproblem, ville det være fantastisk.Hvis der er, vil vores opfølgende artikel specifikt diskutere, hvordan du løser dette problem.
MIQE (6)—qPCR-oligonukleotider
For fluorescerende kvantitativ PCR er den første ting, du kæmper med hver dag, RNA-ekstraktion, og den anden ting kan være primerdesign.
Først og fremmest tjekker vi stadig reglerne om primerdesign i henhold til MIQE-tjeklisten.Det er så simpelt, at skurkene kan grine, og vi kan afslutte det i én sætning: find ud af sekvensen og positionen af primerproben og modifikationsmetoden.For primeroprensningsmetoden er primersyntese så billig på nuværende tidspunkt, qPCR er værdig til PAGE og højere oprensningsmetoder, og informationen om synteseinstrumentet er ikke vigtig.Mange mennesker har lavet primere i årtier og ved ikke, at synthesizeren er ABI3900.
Med hensyn til principperne for primer design, behøver du ikke at huske dem udenad, fordi de fleste primer design software eller online værktøjer kan tage sig af disse problemer (anbefalet online værktøj primer3.ut.ee/), og 99,999% af primer design udføres ikke manuelt. Se, forfatteren designer nogle gange hundredvis af primere om dagen, hvis du læser en kryds efter en.
Bare tjek følgende punkter, efter at primerne er designet:
1. Designprimere tæt på 3'-enden: I tilfælde af brug af oligo-dT-primere til cDNA-førstestrengssyntese, i betragtning af revers transkriptionseffektiviteten og RNA-integriteten, skal de designede primere designes tæt på 3'-enden for at forbedre amplifikationseffektiviteten.Brug et billede til at forklare som følger (der er ingen måde at forstå dette på):
Hvorfor skal primere designes tæt på 3′-enden, det må ikke være sandt
2. TM-værdi: Tm-værdien er ved 55-65°C (fordi exonukleaseaktiviteten er den højeste ved 60°C), og GC-indholdet er på 40%-60%.
3. BLAST: For at undgå uspecifik amplifikation af genomet skal Blast bruges til supplerende verifikation.
MIQE(7)—qPCR-proces
1. qPCR-sæt
I henhold til kravene i MIQE skal vi klart beskrive de komplette reaktionsbetingelser i artiklen, herunder konfigurationen af PCR-reaktionssystemet, hvilket kit der bruges, hvem er producenten, hvor stort er reaktionssystemet, om farvemetoden eller probemetoden anvendes, PCR-programindstillinger.Veteranchauffører vil helt sikkert opdage, at så længe sættet er valgt, er ovenstående information grundlæggende bestemt.
På nuværende tidspunkt er fremstilling og produktion af fluorescerende kvantitative PCR-sæt en meget moden teknologi.Så længe du ikke vælger ekstremt dårlige producenter, er sandsynligheden for problemer ikke stor, men vi vil alligevel gerne dele et par punkter med dig:
Hot-start Taq enzym:Den vigtigste del af PCR er hot-start Taq enzymet.Hot-start enzymerne på markedet er generelt opdelt i to typer, den ene er et kemisk modificeret hot-start enzym (man kan forestille sig det som paraffinindlejring), og den anden er Er et hot-start enzym til antistofmodifikation (antigen-antistofbinding).Kemisk modifikation er en tidlig måde at varmstarte enzymer på.Når en vis temperatur er nået, vil enzymet frigive sin aktivitet.Det antistofmodificerede hot-start enzym bruger biologiske metoder til at blokere enzymets aktivitet.Når en vis temperatur er nået, vil antistoffet blive denatureret og inaktiveret som et protein, og enzymaktiviteten bringes i spil.
Men hvad er brugen af dette?Dette er tilfældet, frigivelsesaktiviteten af antistofmodificerede enzymer er hurtigere end kemisk modificerede enzymer, så følsomhedsmæssigt har antistofmodificerede enzymer en lille fordel, således at der stort set ikke er nogen kemisk modificerede enzymer i kittene på markedet.Hvis der er, så sidder denne producents teknologi stadig fast i årtusindets æra.
Magnesium ion koncentration:Magnesiumionkoncentration er meget vigtig i PCR-reaktionen.Passende magnesiumionkoncentration kan fremme frigivelsen af Taq-enzymaktivitet.Hvis koncentrationen er for lav, vil enzymaktiviteten blive væsentligt reduceret;hvis koncentrationen er for høj, vil den enzymkatalyserede ikke-specifikke amplifikation blive forstærket.Koncentrationen af magnesiumioner vil også påvirke annealingen af primere, templatens smeltetemperatur og PCR-produkter og derved påvirke udbyttet af amplificerede fragmenter.Koncentrationen af magnesiumioner er generelt kontrolleret til 25 mM.For et godt sæt skal koncentrationen af magnesiumioner naturligvis kontrolleres godt.Nogle handlende tilføjer et magnesiumionchelateringsmiddel til reagenset, hvilket kan opnå effekten af automatisk justering af magnesiumionkoncentrationen.
Fluorescerende farvestofkoncentration:Fluorescerende farvestof, som er den SYBR Green, vi normalt bruger, genererer hovedsageligt fluorescens ved at binde sig til den mindre rille af dobbeltstrenget DNA, fordi bindingen af farvestoffet til dobbeltstrenget DNA er uspecifik, det vil sige så længe dobbeltstrenget DNA kombineres med det, kan fluorescens forekomme, så primer-dimerer vil kombineres med primer-dimerer og danne baggrundsskabeloner i systemet.
PS: På grund af dets lysfølsomme egenskaber er produkter på markedet generelt pakket i brune uigennemsigtige centrifugerør (som vist på billedet nedenfor).Dette vil dog støde på et problem.Det er svært at se, om væsken suges ved prøveudtagning.I denne henseende er Qingke faktisk den mest brugervenlige (som vist på billedet nedenfor), og det gennemsigtige rør er pakket i en uigennemsigtig blikpose.Læg det derefter i en blikpose under hensyntagen til bekvemmeligheden ved at undgå lys og prøveudtagning.Du skal vælge det rigtige produktnummer.TSE204 er en super omkostningseffektiv tilværelse, som giver mig lyst til at plante græs.
Koncentrationen af det fluorescerende farvestof er også meget vigtig.Hvis koncentrationen er for lav, vil amplifikationskurven ikke gå op i det senere trin og er ikke perfekt;hvis koncentrationen er for høj, vil det forårsage støjinterferens.Da den fluorescerende kvantitative PCR hovedsageligt afhænger af CT-værdien, er lavpunktet bedre end det højeste, hvis koncentrationen af det fluorescerende farvestof ikke justeres korrekt.Selvfølgelig er den passende farvestofkoncentration den bedste.
ROX: ROX-farvestoffer bruges til at korrigere for fluorescenssignalfejl fra brønd til brønd.Nogle instrumentproducenter kræver kalibrering, mens andre ikke gør.For eksempel kræver brugen af Thermo Fisher Scientifics Real Time PCR-amplifikationsinstrument normalt kalibrering, inklusive 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus osv. De generelle kitinstruktioner vil beskrive det.
Foregenes qPCR Mix indeholder også ROX farvestof, som er praktisk at bruge i forskellige modeller.
Svag hydrogenbindingsbehandling: Behandlingen af svage brintbindinger er en relativt teknisk sag.Intet har læst manualerne til mange sæt, men ingen af dem nævnte dette emne.Faktisk er det så vigtigt.Kombinationen af baser afhænger hovedsageligt af styrken af hydrogenbindinger.Stærke hydrogenbindinger er normal amplifikation, og svage hydrogenbindinger fører til uspecifik amplifikation.Hvis svage hydrogenbindinger ikke kan elimineres godt, kan uspecifik amplifikation ikke undgås.Inden for forfatterens omfang har kun få virksomheder bemærket dette problem.Når du køber sættet, kan du henvise til, om du har overvejet en løsning i denne forbindelse til det sæt, du ønsker at vælge.
Reaktionsvolumen: 20-50ul-systemet er mere almindeligt anvendt, og mindre volumener vil sandsynligvis forårsage fejl.Generelt vil kitinstruktionerne anbefale brugen af PCR-reaktionsvolumener.Vær ikke smart og brug mindre mængder for at spare omkostninger.målet om.Den mængde, som sælgerne anbefaler, er faktisk blevet testet, og det kan være, at de ikke kan løse problemet med fejl forårsaget af små mængder.
2. Producent og varenummer på rørpladen
Alle kender princippet om fluorescerende kvantitativ PCR.Fluorescensopsamling udføres hovedsageligt gennem PCR-rørshætter.Når du vælger PCR-forbrugsstoffer, skal du være opmærksom på to punkter: god lystransmission og egnet til instrumentet.Generelt er pladerne og rørene fra mainstream-mærker fine, men du skal vælge med omhu i forhold til tilpasning, ellers vil du ikke kunne bruge instrumentet.
4. Viden på topniveau
MIQE (8)—qPCR-validering
Dette er topprioriteten for qPCR!Så mange helte er faldet i sandet her.Det er selvfølgelig også muligt, at du er heldig, og de gener, du har studeret, er simple, så du svævede gennem ishulen langs vinden.Verifikationsoplysningerne for qPCR er beregnet til at teste pålideligheden af dataene.Vi angiver de nødvendige verifikationsoplysninger som følger:
1.Specificitetstest
Specificiteten af målgenamplifikation testes ved at kontrollere, om elektroforesebilledet er et enkelt bånd;sekventering verifikation;smeltekurve for at se, om topkortet er enkelt;verifikation af enzymfordøjelse og andre metoder.
Her fokuserer vi på tanalyse af uspecifik amplifikation ved hjælp af metoden til smeltekurver.Generelt set, når vi designer primere, skal størrelsen af produktfragmentet være i området 80-200bp, hvilket gør smeltetemperaturen for PCR-produktet 80-85 °C.Derfor, hvis der er diverse toppe, skal der være andre ikke-specifikke amplifikationsprodukter;hvis toppen viser sig under 80°C, anses den generelt for at være en primerdimer;hvis toppen viser sig over 85°C, anses det generelt for at være DNA-kontamination eller mere uspecifik amplifikation af store fragmenter.
Bemærk: Nogle gange er der kun en enkelt top ved 80°C.På nuværende tidspunkt skal dette koncept overholdes.Det er sandsynligt, at amplifikationsresultaterne alle er primerdimere.
Normal smeltekurve (enkelt top uden uspecifik amplifikation)
Problematisk smeltekurve (uspecifik forstærkning af falske toppe)
【Caseanalyse】
Der er en hovedtop, men primer-dimeren er alvorlig
Enkeltspids-smeltekurven i figuren nedenfor kan nemt snyde dine øjne, og tro at det er et perfekt eksperiment, men resultatet er helt forkert.På dette tidspunkt skal vi se på smeltetemperaturen.Toptemperaturen er under 80°C, hvilket er fuldstændig primer-dimer.
Intet målfragment, alle primer-dimere
Her kan min bror ikke stoppe.Billedet nedenfor er et billede taget med en mobiltelefon sendt til mig af en svineri.De reagenser, han brugte, er alle almindeligt anvendte mærker i branchen.Han skiftede fra et T-præfiksmærke til et andet T-præfiksmærke.Jeg tror, du allerede har gættet det.Skumlen råbte til mig: "Reagenset brugt på det første billede er for godt, og toppen er enkelt.Senere, efter at have brugt det reagens, du anbefalede, bliver det som det andet billede med blandede toppe.Du har gjort mig ulykkelig.“
Adskil de to grafer.Ved første øjekast har den ene en enkelt top, og den anden har en dobbelt top.Nonsens, en enkelt top er selvfølgelig fint.Er det sandt?
Værre end Dou E, hvis jeg sætter de to billeder på billedet nedenfor, vil du straks forstå.Faktisk bliver vi let lammet af denne slags billeder.Efter omhyggelig analyse fandt vi ud af, at: toppen af den første figur er ved 75°C, hvilket er fuldstændig primer-dimer;toppen af den anden figur vises ved 75°C og 82°C, i det mindste er der Produktet vises.
Billeder af feedback fra elever
Så det grundlæggende problem er ikke problemet med reagenser, men problemet med primerdesign.Samtidig beviser det også, at nogle store mærker ikke er af jernkvalitet, og det beviser også, hvad min bror sagde før: Det er ikke reagensmærket, der understøtter din artikel.Det er din artikel, der understøttede mærket af reagenser.Forestil dig bare, at hvis svinet ikke ændrede reagenserne, ville de forkerte data blive sendt til journalen, og det, der ville ske, ville være en tragedie.
2. Ct-værdi for blindkontrol
Forklar ikke, hvis blankkontrollen har en Ct-værdi, er det ikke forurening?Du skal dog stadig forstå, hvilken blank kontrol der har en Ct-værdi.Hvis det er NTC, betyder det, at der er fremmed DNA såsom reagenskontamination.Hvis det er NRT, betyder det, at det ekstraherede RNA har DNA-kontaminering.
3. Standardkurve
Inklusive hældnings- og beregningsformlen kan PCR-effektiviteten beregnes gennem formlen.Et perfekt eksperiment kræver, at hældningen af standardkurven nærmer sig 3,32, og at R² nærmer sig 0,9999.
4. Lineært dynamisk område
Det dynamiske område af reaktionen er lineært.Ifølge skabelonen, der bruges til at generere standardkurven, skal det dynamiske område omfatte mindst 5 koncentrationsgradienter og være opmærksom på ændringen af Ct-værdier ved høje koncentrationsgradienter og lave koncentrationsgradienter.
5. Detektionsnøjagtighed
Ændringer i qPCR-resultater, det vil sige dårlig repeterbarhed, det vil sige dårlig præcision, er forårsaget af mange faktorer, herunder temperatur, koncentration og drift.qPCR-præcision bliver generelt mindre kontrollerbar, når kopiantallet falder.Ideelt set inden for eksperimentel variation bør denne tekniske variation være adskilt fra biologisk variation, og biologiske replikater kan direkte adressere statistiske forskelle i qPCR-resultater mellem grupper eller behandlinger.Især for diagnostiske assays skal den bedste inter-assay-præcision (gentagelighed) på tværs af steder og operatører rapporteres.
6. Detektionseffektivitet og LOD (i multiplex qPCR)
LOD er den laveste koncentration på 95 % af positive prøver påvist.Med andre ord bør koncentrationen af LOD indeholdt i et sæt målgenreplikater ikke overstige 5 % af de fejlslagne reaktioner.Når der udføres multiplex qPCR-analyse, især til samtidig påvisning af punktmutationer eller polymorfismer, skal multiplex qPCR bevise, at nøjagtigheden af flere målfragmenter ikke kompromitteres i det samme rør, multipel detektion og enkeltrørsdetektion Effektivitet og LOD bør være den samme.Især når højkoncentrationsmålgener og lavkoncentrationsmålgener samtidig amplificeres, skal dette problem være opmærksom på.
Problemer og løsningerGenerelt set fokuserer de problemer, man ofte støder på i qPCR-fejlretning, på følgende aspekter:
·uspecifik amplifikation
·Svært valg af primerkoncentration og problemer med primer-dimere
·Glødetemperaturen er unøjagtig
·Sekundær struktur påvirker forstærkningseffektiviteten
uspecifik amplifikation
ikke-specifik amplifikationforekommer, overvejes det generelt, om primerdesignet ikke er egnet, men hvis du ikke har travlt med at skifte primerne, kan du prøve følgende metoder først (princippet er også vedlagt):
· Øg udglødningstemperaturen – prøv at få svage brintbindinger ude af stand til at opretholde;
· Forkort annealing og forlængelsestid - reducer chancen for svage hydrogenbindinger;
·Reducer primerkoncentrationen – reducer chancen for binding af redundante primere og ikke-målområder;
Lav forstærkningseffektivitet
Den modsatte situation til ikke-specifik amplifikation – lav amplifikationseffektivitet, og foranstaltningerne til at håndtere lav amplifikationseffektivitet er lige det modsatte:
· Forlænge udglødnings- og forlængelsestiden;
· Skift til tre-trins PCR og reducer udglødningstemperaturen;
· Øg primerkoncentrationen;
Ps: Mange kandidatstuderende født i 90'erne er uvillige til at studere, hvordan man fejlfinder eksperimenter, og håber, at sættet fuldstændigt kan løse problemet (hvis du vil gå til et reagensfirma for at lave forskning og udvikling efter endt uddannelse), faktisk tænker reagensproducenterne også sådan, jeg håber, det er et fjols. Det kan bruges, når du får det, så reagensproducenter har brugt en masse af ikke-specifikke anstrengelser på at løse problemet, inklusive introduktion. absorptionsfaktorer.For nemt at løse problemet, skal fjols stadig læse introduktionen af reagensfirmaet for at se, om der er en faktor, der absorberer svage brintbindinger.
Svært valg af primerkoncentration og problemer med primer-dimere
Metode 1: Generelt har kitinstruktionerne til qPCR anbefalede systemer og anbefalede primerkoncentrationer.
Metode 2: Fejlretning ved at indstille primerkoncentrationsgradienten.Billedet nedenfor er stjålet fra et firma for at illustrere.Figuren nedenfor viser de kvantitative fluorescensresultater lavet med tre primerkoncentrationsgradienter (100 nM, 250 nM, 500 nM) og fire skabelonkoncentrationsgradienter (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Ct-værdien af de eksperimentelle resultater er plottet som følger:
Valg af primerkoncentration Sammensæt hver primerkoncentration i en linje som følger:
Valget af primerkoncentration er indlysende, det lineære forhold mellem primerkoncentrationen på 100 nM og 250 nM er bedre, og det lineære forhold mellem primerkoncentrationen på 500 nM er relativt dårligt.I 100nM og 250nM er Ct-værdien på 250nM relativt lille, så den optimale primerkoncentration er 250nM.Generelt kan alvorlige primer-dimerer ses i smeltekurven.Hvad hvis de designede primere ikke kan undgå primer-dimere?
Metode 3: Reducer mængden af primere og øg annealingstemperaturen (ingen grund til at forklare).
Den empiriske værdi af udglødningstemperaturen er 60°C.Hvis du ikke er sikker, hvordan vælger du en mere passende udglødningstemperatur?Svaret er det samme som valget af primerkoncentration –gradient test.Tag et billede fra Bio-rad firmaet for at illustrere problemet.Til amplifikation af et bestemt målfragment skal du indstille otte temperaturgradienter, hver med tre gentagelser, og den opnåede amplifikationskurve er som følger:
valg af udglødningstemperatur:
·70°C, 69°C – Grundlæggende kan primerne ikke kombineres, så der er ingen amplifikation.
·67,3°C – Der er en lille mængde forstærkning i begyndelsen, og Ct-værdien er relativt stor.
·64,5°C——Ct-værdien falder.
·Ved 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C og 55,0°C havde Ct-værdierne grundlæggende tendens til at være stabile, men de endelige fluorescensværdier var forskellige.
Hvordan vælger man?Princip: Det første princip er den højere Ct-værdi.For den samme Ct-værdi skal du vælge en højere annealingstemperatur for at undgå dimerisering og uspecifik amplifikation.Selvom der er en højere fluorescensværdi ved 55°C, kan der være dimerer eller ikke-specifik amplifikation i den.
Men hvis du er lige så klog som dig, vil du helt sikkert tænke: Logisk set, hvis PCR-reaktionen er meget specifik, så længe primerkoncentrationen overstiger minimumskravet, skulle høje og lave punkter ikke have nogen effekt, ligesom fluorescerende farvestoffer og dNTP'er.Så længe annealingstemperaturen er optimeret korrekt, vil virkningen af primerkoncentrationen på Ct-værdien naturligvis blive minimeret.
Udglødningstemperaturen er optimeret korrekt, og effekten af primerkoncentration på CT vil blive minimeret
Sekundær struktur påvirker forstærkningseffektiviteten
Lad os tage billedet fra Bio-rad for at illustrere problemet.Det designer også en temperaturgradient til at amplificere et gen med en sekundær struktur.
Sekundær struktur opstår
Det kan ses, at når temperaturgradienten falder, begynder produkter at dukke op, og Ct-værdien bevæger sig fremad, når minimumsværdien ved 60,7°C, og når temperaturgradienten falder, bliver Ct-værdien større.Omvendt, når temperaturen stiger, åbner den sekundære struktur sig, og forstærkningseffektiviteten øges.Efter at have nået en vis temperatur kan en forøgelse af temperaturen ikke forbedre forstærkningseffektiviteten.Fordi primerne ikke kan kombineres stabilt på dette tidspunkt.Derfor,se efter temperaturen med den laveste Ct-værdi, som er den bedste temperatur til at forstærke den sekundære strukturskabelon!Selvfølgelig skal smarte fjolser vide, at hvis det ikke er nødvendigt, er det bedst at ændre primerne og undgå den sekundære strukturregion.
5. Anvendelsesniveau
MIQE—Dataanalyse
Dataanalysen er hovedsageligt givet af det fluorescerende kvantitative PCR-instrument.I den foregående artikel er der lavet en del dataanalysearbejde, som fx blankkontrollen, som er blevet forklaret i forsøgets design.De interne referencegener, gentagelsesnumre osv. er afklaret., her forklarer vi hovedsageligt anvendelsen af qPCR.
qPCR er meget udbredt, og eksperimentel verifikation og nukleinsyrediagnose er de mest almindeligt anvendte scenarier.
absolut kvantificering
Log (initialkoncentration) har en lineær sammenhæng med antallet af cyklusser.En standardkurve kan tegnes fra en standard med kendt initial kopiantal, dvs. det lineære forhold mellem amplifikationsreaktionen kan opnås.I henhold til prøvens Ct-værdi kan koncentrationen i prøven beregnes.Mængden af skabeloner, der skal inkluderes.
Absolut kvantitativ beregningsmetode
Absolut kvantificering skal baseres på standardkurven.For at lave en standardkurve kræves en standard.Normalt er standarden et plasmid opnået ved kloning af målgenet.Hvorfor er det et plasmid?Fordi cirkulært plasmid DNA er det mest stabile.Fortynd standardproduktet i 5 til 6 gradienter i henhold til fordoblingsforholdet (10 gange fortynding), og vær opmærksom på ensartetheden ved fortynding.Lad Ct-værdien falde mellem 15-30.
Standard forberedelse
Samtidig skal prøven, der skal testes, også fortyndes i overensstemmelse hermed (husk fortyndingsfaktoren), og Ct-værdien skal også falde mellem 15-30.Standardproduktet + prøven, der skal testes, sættes sammen på maskinen.Efter kørslen blev der lavet en standardkurve med standardstoffet, og prøverne, der skulle testes, blev bragt ind i standardkurven for at beregne koncentrationen.
Hepatitis B virus HBV kvantificering er en typisk absolut kvantificering, som kan beregne viruskopitallet i 1 ml blod.
Beregning af kopinummer
Prøvekoncentration, der skal testes (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × fortyndingsfaktor
Prøvens molekylvægt = antal baser × 324
Kopinummeret for prøven, der skal testes (kopier/ul) = koncentrationen af prøven, der skal testes / molekylvægten af prøven × 6 × 1014
Beregningsmetode for kopinummer
Ovenstående er beregningsmetoden til bestemmelse af mængden.Dette er et matematisk problem, der kan løses efter endt uddannelse fra ungdomsskolen, og matematiske problemer løses generelt af computere.Hvis du ikke forstår, kan du komme for at kommunikere.
relativ kvantificering
Relativ kvantificering bruges hovedsageligt i videnskabelig forskning.Hvor mange vira er der i 1 ml blod, og det er en DNA-virus, dette er en relativt deterministisk begivenhed: mængden af blod kan bestemmes, og DNA-viruset er relativt stabilt.Det er imidlertid vanskeligt for os at sammenligne antallet af transskriptionskopier af et bestemt gen i et blad, fordi det er svært at bestemme størrelsen, vægten og ømheden af bladet, mængden af ekstraheret RNA er svær at bestemme, og effektiviteten af omvendt transkription er også svær at bestemme, det vil sige, at ethvert trin kan få de eksperimentelle data til at have fejl og ikke kan bruges.
Derfor skal relativ kvantificering indføre et element:det interne referencegen.
Med andre ord er relativ kvantificering faktisk en sammenligning mellem målgenet og det interne referencegen.Sammenlignet i det samme væv og den samme celle er indflydelsen af prøvestørrelse, RNA-ekstraktionsmængde, revers transkriptionseffektivitet og PCR-effektivitet relativt lille.På grund af den lille prøvestørrelse var både interne referencegener og målgener relativt reduceret.Det er derfor, vi før har lagt vægt på ensartethed og stabilitet.
Interne referencegener er generelthusholdningsgener(husholdningsgener), som refererer til en klasse af gener, der er stabilt udtrykt i alle celler, og deres produkter er nødvendige for at opretholde cellernes grundlæggende livsaktiviteter.
Forveksle ikke dette koncept.Husholdningsgener er biologiske funktionsbegreber, mens interne referencegener er eksperimentelle tekniske udtryk.Husholdningsgener skal bestå validering, før de kan vælges som interne referencegener.
For eksempel valgte vi flere husholdningsgener i figuren nedenfor for at teste deres ekspressionsniveauer i forskellige vævsceller og fandt ud af, at ekspressionsniveauerne af β-2-mikroglobulin var ret forskellige fra dem i de tre andre gener, så de kunne ikke bruges som interne referencegener.
Efter at have forstået korrektionsfunktionen af det interne referencegen, udledes to algoritmer på grund af indførelsen af det interne referencegen.
·dobbelt standard kurvemetode
·2 – △△Ct-metode (CT-værdisammenligningsmetode)
Hvis du er interesseret i at studere arter og genfunktioner, så opgiv venligst forskningen i algoritmer og brug formler direkte, eller brug maskiner direkte;hvis du er en heteroseksuel fyr i matematik og teknik, er du velkommen.
dobbelt standard kurvemetode
Kvantificer målgenet og husholdningsgenet for kontrolprøven og prøven, der skal testes, gennem standardkurven, og beregn derefter den relative værdi i henhold til beregningsformlen, som er det relative ekspressionsniveau.
Fordele: enkel analyse, relativt simpel eksperimentel optimering
Ulempe: For hvert gen skal hver forsøgsrunde lave en standardkurve
Anvendelse: En af de to mest almindeligt anvendte og anerkendte relative kvantitative metoder i studiet af genekspressionsregulering
Formlen er som følger:
Eksempler er som følger:
Beregn den relative mængde baseret på det kvantitative resultat
2 – △△Ct-metode (CT-værdisammenligningsmetode)
Fordele: Ingen grund til at lave en standardkurve
Ulemper: Det antages, at amplifikationseffektiviteten er tæt på 100 %;standardafvigelsen er < 5 %, og standardkurven og effektiviteten mellem hver amplifikation antages at være konsistente;optimering af eksperimentelle forhold er mere kompliceret.
Anvendelse: En af de to mest almindeligt anvendte og anerkendte relative kvantitative metoder i studiet af genekspressionsregulering
Selvfølgelig er amplifikationseffektiviteten normalt umulig at være perfekt 1. Korrektionsmetode: Hvis vi ved, at målgenet og referencegenet har samme amplifikationseffektivitet, men amplifikationseffektiviteten er ikke lig med 1, så kan 2－△△Ct korrigeres som: (1+E )－△△Ct, så kan den korrekte amplifikationseffektivitet f.eks. være 0 til 5. .95–△△Ct
Indtil videre er indholdet om fluorescerende kvantitativ PCR kommet til en ende.
Posttid: Apr-06-2023
