Søjlen tilstoppet

Efter at søjlen er tilstoppet, er RNA-udbyttet reduceret eller endda umuligt at oprense RNA'et, og den opnåede RNA-masse er lav.

Almindelig årsagsanalyse:

1. Prøvepauser er ikke grundige.

Prøvebrud forårsager ikke fuldstændig blokering af DNA-RENSENDE KOLONNE, mens det påvirker RNA-udbyttet og -kvaliteten.Vi anbefaler hurtig slibning i et tilstrækkeligt flydende nitrogen, når du knækkede prøverne. Prøv at knuse prøvens cellevæg, cellemembran og andet væv.Til planteprøver af polyolpolysaccharider anbefaler vi, at du bruger Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

2. Når den separerede prøvesupernatant suges med DNA-rensningssøjle, kan det mulige cellefragmenterede præcipitat inhaleres.

De cellefragmenterede sedimenter, der tages, vil forårsage RNA-KUN-kolonnen, som vil blive blokeret, når RNA-adsorptionsoperationen udføres (se trin 6).Vi anbefaler, at du omhyggeligt suger denne supernatant for at undgå, at cellerester suges.

3. Prøveindledende mængde er for meget.

Overdreven prøvebrug vil resultere i ufuldstændig prøvefragmentering eller ufuldstændig cellelyse af buffer PSL1, hvilket resulterer i blokering af oprensningssøjlen under oprensning.Plant Total RNA Isolation Kit Hver enkelt oprenset driftsprøve er 50 mg.For planteprøver af polyolpolysaccharider anbefaler vi, at du prøver Plant Total RNA ISOLATION KIT PLUS.

4. Centrifugens temperatur er for lav.

Hele RNA-isolering og oprensningsprocessen udføres ved stuetemperatur (20-25°C), bortset fra at prøvevævet brydes af flydende nitrogen. Temperaturen af ​​nogle kryogene centrifuger er lavere end 20 grader℃, hvilket kan forårsage blokering af DNA-rensende kolonne og/eller RNA-kun kolonne.Hvis dette sker, skal du indstille centrifugetemperaturen til 20-25℃, ogsørg for, at lysisblandingen og/eller den ethanoltilsatte supernatant var forvarmet til 37°C.

Intet RNA ekstraheret eller RNA-udbyttet er lavt

Der er normalt mange faktorer, der påvirker genvindingseffektiviteten, såsom: prøve-RNA-indhold, operationsmetode, elueringsvolumen osv.

Analyse af almindelige årsager som nedenfor:

1. Et isbad eller lav temperatur (4°C) centrifugering blev udført under operationen.

Forslag: Kør ved stuetemperatur (15-25°C) I hele processen skal du ikke lave isbad og lavtemperaturcentrifugering.

2. RNA'et er blevet nedbrudt på grund af forkert konservering af prøven eller langtidskonservering af prøven.

Anbefaling: Frisk indsamlede prøver skal hurtigt fryses i flydende nitrogen og derefter opbevares ved -80°C i lang tid, undgå gentagen frysning og optøning af prøver;eller læg straks prøverne i blød i RNA-stabilisator RNAlater-opløsning (dyreprøver).

3.Utilstrækkelig prøvefragmentering og lysis fører til blokering af oprensningssøjlen.

Forslag: Når vævet slibes, skal du sørge for, at vævet er tilstrækkeligt formalet, og hurtigt overføre det til den præparerede buffer PSL1 (bekræft, at den korrekte andel af β-ME er blevet tilføjet, se trin 1 i proceduren).

4. Eluenten blev tilsat forkert.

Forslag: Sørg for, at RNase-Free ddH2O dryppes ind i midten af ​​rensekolonnens membran.

5. Det korrekte volumen af ​​absolut ethanol blev ikke tilsat buffer PSL2 eller Buffer PRW2.

Forslag: Følg venligst instruktionerne, tilsæt den korrekte mængde absolut ethanol til Buffer PSL2 og Buffer PRW2 og bland godt, før sættet bruges.

6. Mængden af ​​vævsprøve er uhensigtsmæssig.

Forslag: Brug 50 mg væv pr. 500 μl buffer PSL1.Brug af for meget væv vil reducere mængden af ​​ekstraheret RNA, og renheden af ​​det resulterende RNA vil også blive reduceret.Vi anbefaler kraftigt, at den indledende prøvedosis ikke bør overstige 50 mg pr. RNA-ekstraktionsoperation.

7. Upassende elueringsvolumen eller ufuldstændig eluering.

Forslag: Rensningskolonnens eluentvolumen er 50-200 μl;hvis elueringseffekten ikke er tilfredsstillende, anbefales det at forlænge tiden ved stuetemperatur efter tilsætning af forvarmet RNase-fri ddH2O, såsom 5-10min.

8. Oprensningssøjlen har ethanolrest efter vask med BufferPRW2.

Forslag: Hvis det tomme rør centrifugeres i 1 min, og der stadig er ethanol tilbage efter vask i Buffer PRW2, kan du øge tiden for det tomme rørs centrifugering til 2 min, eller placere rensesøjlen ved stuetemperatur i 5 min for helt at fjerne den resterende ethanol.

9. Sættet blev brugt forkert.

Forslag: For planteprøver af polyphenoliske polysaccharider kan brug af almindelige kits såsom Plant Total RNA Isolation Kit muligvis ikke opnå ideelle RNA-prøver.Vi anbefaler dig at bruge Plant Total RNA IsolationKit Plus, som er specielt designet til polyphenoliske polysaccharid planteprøver.Et sæt specielt udviklet til at udvinde RNA fra polyphenol og polysaccharid planteprøver.

OD260/OD280-værdien er lav

RNA-eluering med ddH2O og brugt til spektrofotometeraflæsninger resulterer i lave OD260/OD280-værdier.Vi anbefaler at bruge 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (i stedet for RNase-fri ddH2O til at eluere RNA) for at opnå relativt korrekte OD260/OD280-værdier, se "RNA-koncentrations- og oprensningsassays" på side 19.

Det oprensede RNA nedbrydes

Kvaliteten af ​​oprenset RNA er relateret til faktorer som prøvekonservering, RNase-kontamination og manipulation.

Analyse af almindelige årsager:

1. Vævsprøver blev ikke opbevaret i tide efter indsamling.

Anbefaling: Hvis vævsprøverne ikke bruges i tide efter indsamling, skal du opbevare dem i flydende nitrogen ved lav temperatur med det samme eller overføre dem til -80°C til langtidsopbevaring efter hurtig nedfrysning i flydende nitrogen, eller straks nedsænke prøverne i RNA-stabilisator RNAlater-opløsning (dyreprøver).For RNA-ekstraktion, prøv at bruge frisk indsamlede vævsprøver.

2. Gentagen nedfrysning og optøning af vævsprøver.

Forslag: Når du opbevarer vævsprøver, er det bedst at skære dem i små stykker til konservering, og tage en del af dem ud, når du bruger dem for at undgå nedbrydning af RNA forårsaget af gentagen frysning og optøning af prøverne.

3.RNase indføres i operationsstuen eller ikke-bårne engangshandsker, masker mv.

Forslag: RNA-ekstraktionsforsøg udføres bedst i separate RNA-operationer, og laboratoriebordet bør rengøres før forsøget, og engangshandsker og -masker bør bæres under forsøget for at undgå RNA-nedbrydning forårsaget af introduktion af RNase i størst muligt omfang.

4.Reagenset er kontamineret med RNase under brug.

Forslag: Udskift med en ny serie af plante-total-RNA-ekstraktionssæt til relaterede eksperimenter.

5. Centrifugerørene og pipettespidserne, der bruges til RNA-manipulation, er kontamineret med RNase.

Forslag: Sørg for, at de centrifugerør, pipettespidser, pipetter osv., der bruges til RNA-ekstraktion, alle er RNase-frie.

Instruktionsmanualer:

Plant Total RNA Isolation Kit Plus Instruktionsmanual