Vi har været erfaren producent.Vinder flertallet i de afgørende certificeringer af sit marked for store rabatter Kina High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Kvalitet er fabrikkens liv, Fokus på kundens efterspørgsel er kilden til virksomhedens overlevelse og udvikling, Vi overholder ærlighed og god tro arbejdsattitude, ser frem til dit kommer!
Vi har været erfaren producent.Vinder flertallet i de afgørende certificeringer af sit marked forKina Taq DNA-polymerase, Qpcr, Vores virksomhed lover: rimelige priser, kort produktionstid og tilfredsstillende eftersalgsservice, vi byder dig også velkommen til at besøge vores fabrik, når som helst du ønsker det.Vi ønsker nu at have en behagelig og langsigtet forretning sammen!!!

Beskrivelser

Dette kit bruger et unikt lyseringsbuffersystem, der hurtigt kan frigive RNA fra dyrkede celleprøver til RT-qPCR-reaktioner, og derved eliminere den tidskrævende og besværlige RNA-oprensningsproces.RNA-skabelonen kan fås på kun 7 minutter.Reagenserne 5×Direct RT Mix og 2×Direct qPCR Mix-SYBR leveret af kittet kan hurtigt og effektivt opnå kvantitative PCR-resultater i realtid.

5×Direct RT Mix og 2×Direct qPCR Mix-SYBR har stærk inhibitortolerance, og lysatet af prøverne kan bruges som skabelon for RT-qPCR direkte.Dette sæt indeholder den unikke RNA højaffinitet Foregene revers transkriptase og Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl₂, reaktionsbuffer, PCR-optimering og stabilisator.

specifikationer

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Sættets komponenter

Egenskaber og fordele

■ Enkel og effektiv: Med Cell Direct RT-teknologi kan RNA-prøver opnås på kun 7 minutter.

■ Prøvebehovet er lille, så lavt som 10 celler kan testes.

■ Høj gennemstrømning: den kan hurtigt detektere RNA i celler dyrket i 384, 96, 24, 12, 6-brønds plader.

■ DNA Eraser kan hurtigt fjerne frigivne genomer, i høj grad reducere indvirkningen på efterfølgende eksperimentelle resultater.

■ Optimeret RT- og qPCR-system gør to-trins RT-PCR revers transkription mere effektiv og PCR mere specifik og mere modstandsdygtig over for RT-qPCR-reaktionshæmmere.

Kit ansøgning

Anvendelsesområde: dyrkede celler.

- RNA frigivet ved prøvelysis: gælder kun for RT-qPCR-skabelonen i dette kit.

- Sættet kan bruges til følgende formål: genekspressionsanalyse, verifikation af siRNA-medieret gendæmpende effekt, lægemiddelscreening mv.

Diagram

Opbevaring og holdbarhed

Del I af dette sæt skal opbevares ved 4 ℃;Del II skal opbevares ved -20℃.

Foregene Protease Plus II skal opbevares ved 4 ℃, må ikke fryses ved -20 ℃.

Reagens 2×Direct qPCR Mix-SYBR skal opbevares ved -20℃ i mørke;hvis det bruges ofte, kan det også opbevares ved 4 ℃ til korttidsopbevaring (brug op inden for 10 dage). Vi har været erfarne producent.Vinder flertallet i de afgørende certificeringer af sit marked for store rabatter Kina High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Kvalitet er fabrikkens liv, Fokus på kundens efterspørgsel er kilden til virksomhedens overlevelse og udvikling, Vi overholder ærlighed og god tro arbejdsattitude, ser frem til dit kommer!
Stor rabatKina Taq DNA-polymerase, Qpcr, Vores virksomhed lover: rimelige priser, kort produktionstid og tilfredsstillende eftersalgsservice, vi byder dig også velkommen til at besøge vores fabrik, når som helst du ønsker det.Vi ønsker nu at have en behagelig og langsigtet forretning sammen!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat.nr.DRT-01021/01022

Til celledirekte RT-qPCR ved brug af ≤ 1000.000 celler

Produktintroduktion

Dette produkt bruger et unikt lyseringsbuffersystem til hurtigt at frigive RNA fra dyrkede celleprøver til RT-qPCR-reaktioner, hvilket eliminerer den tidskrævende og besværlige RNA-oprensningsproces, og kun 7 minutter til at opnå den nødvendige RNA-skabelon, med 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman leveret af kittet kan hurtigt og effektivt opnå PCR-resultater i realtid.

5× Direct RT Mix og 2× Direct qPCR Mix-Taqman har stærk inhibitortolerance og kan udføre effektiv reversering og specifik amplifikation ved at bruge lysatet af prøven, der skal måles som en skabelon.Reagenset indeholder Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA-polymerase, dNTP'er, MgCl₂, Reaction Buffer, PCR Optimizer og Stabilizer, som kan bruges sammen med lyseringsbuffer til hurtigt og nemt at detektere prøver og har karakteristika af høj sensitivitet, specificitet og stabilitet.

Produktegenskaber

Enkel, effektiv Cell Direct RT-teknologi, der tager så lidt som 7 minutter at få RNA-prøver.

Prøvekravene er små, og minimum 10 dyrkede celler kan bruges til eksperimenter.

Høj gennemstrømning til hurtig RNA-optagelse af dyrkede celler, såsom 384, 96, 24, 12 og 6-brønds plader.

DNA Eraser er i stand til hurtigt at fjerne frigivne genomer, hvilket i høj grad reducerer indvirkningen på efterfølgende eksperimentelle resultater.

Optimerede RT- og qPCR-systemer muliggør to-trins RT-PCR med mere effektiv revers transkription, specificitet og stærkere RT-qPCR-reaktionsinhibitortolerance.

Kit ansøgning

Anvendelsesområde: Dyrkede celler.

Prøvelyse fortolket RNA: bruges kun som en to-trins RT-qPCR-skabelon.

Kits kan bruges til følgende formål: genregulerende ekspressionsanalyse, alleltestning, lægemiddelscreening osv.

Kit begrænsninger

Amplificerede fragmenter ≤ 300 bp.

Kits bruges til friskdyrkning af celler.

Produktkvalitetskontrol

I henhold til FOREGENE's Total Quality Management System testes hver batch af Cell Direct RT-qPCR serie kits omhyggeligt flere gange for at sikre pålideligheden og stabiliteten af ​​kvaliteten af ​​hver batch af kits.

Sættets indhold

*:Cellelysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman kan købes separat, detaljer findes i Appendiks 1 (SIDE 13).

Opbevaringsforhold

1. Forsendelsesbetingelser

Hele processen med lavtemperatur isposetransport for at sikre, at sættet er i tilstanden <4 °C.

2. Opbevaringsforhold

Opbevar del I ved 4°C og del II ved -20°C.

Foregene Protease Plus II bør opbevares ved 4°C, ikke frosset ved -20°C.

Reagens 2× Direct qPCR Mix-Taqman opbevares ved -20°C eller ved 4°C til kortvarig brug, hvis det bruges ofte (inden for 10 dage).

Oplysninger om kitkomponenter

Buffer CL: Giver det miljø, der kræves til cellelysereaktioner.

Buffer ST: Afslutter det aktive stof i lysatet for at undgå effekter på efterfølgende RT.

DNA Eraser: DNA-fjerner, effekten af ​​at fjerne genomet på efterfølgende eksperimenter.

5× Direct RT Mix: Indeholder høj RNA affinitet Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTP'er, stabilisatorer, enhancere, optimizers og reverse transcription primere for optimal alignment (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: I forbindelse med lysisbuffer lyseres celler for at frigive nukleinsyrer.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Dette reagens indeholder Hot D-Taq DNA-polymerase, dNTP'er, MgCl₂, reaktionsbuffer, PCR-optimering og stabilisator.

20× ROX referencefarve: Anvendes generelt på realtids PCR-amplifikationsinstrumenter fra ABI, Stratagene og andre virksomheder, det bruges til at justere forskellen mellem PCR-rør og -rør forårsaget af PCR-doseringsfejl.Den 20× ROX referencefarvekoncentration, der kræves til forskellige instrumenter, er forskellig, og brugeren kan tilføje den i henhold til den anbefalede koncentration af instrumentet.

RNase-fri ddH₂O: RNase-frit steriliseret ultrarent vand til to-trins RT-qPCR-reaktioner.

Forholdsregler:(Sørg for at læse forholdsreglerne omhyggeligt, før du bruger sættet)

Vær opmærksom på eksperimentets operationsmetode for at undgå krydskontaminering mellem prøver.

Vær opmærksom på renheden af ​​det eksperimentelle miljø og redskaber for at undgå RNase-kontamination og RNA-nedbrydning.

Tag friske eller velbevarede celleprøver og brug aldrig gentagne fryse-optøede celleprøver.

5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix-Taqman bør undgå gentagen frysning-optøning, ellers vil det påvirke omvendt transkription og PCR-effektivitet.

PreparationerFøroperation

Sørg for at læse instruktionerne omhyggeligt, før du bruger dette sæt.Cell Direct RT-qPCR-sættet er enkelt, praktisk og hurtigt at betjene, og instruktionerne giver fuldstændig information om hele sættet, og hvordan det bruges korrekt.Forbered venligst de nødvendige eksperimentelle materialer og udstyr før brug.

Eksperimentelle materialer og udstyr

◆ Kulturceller.

◆ 1,5 ml eller 2 ml, RNase-/DNase-fri centrifugerør, RNase-/DNase-fri spids, 0,2 ml sterilt qPCR-rør.

◆ qPCR maskine, pipette, bordplade centrifuge (≥13.400×g) (afhængig af forsøgsbehov) mv.

Sikkerhed

◆ Dette produkt er kun til videnskabelige forskningsformål. Brug det ikke til farmaceutiske, kliniske, fødevare- og kosmetiske formål.

◆ Når du bruger kemikalier, skal du bære passende laboratorietøj, handsker, beskyttelsesbriller osv.

Operationguider

Cellelysesystemer, RT-systemer og qPCR-reaktionsopløsningstilskudspakker kan købes separat, for detaljer i appendiks 1 (SIDE 13).

Driftsvejledning

A: Prøve RNA-frigivelse

1. Celler blev forbehandlet: Vask cellekulturpladen med kold PBS, og lysér derefter cellerne (10-10⁶), 10⁶ end antallet af celler, anbefales Foregene the Cell an RNA Isolation Kit Total (DE-03111) eller Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) til RNA-ekstraktion og oprensning.

1.1.Adhærente celler (24-brønds plade som et eksempel)

1.1.1.Bestem antallet af celler i hver brønd, bestem, at antallet af celler er 1 × 10⁵, og brug en pipette til at fjerne dyrkningsmediet fra dyrkningsskålen.

1.1.2.Tilsæt 200 μl forkølet 1 × PBS til hver brønd.Undlad at pipettere gentagne gange og fjerne PBS fra brøndene.Vip pladen og fjern så meget PBS som muligt.Fortsæt til trin 2.

1.1.3.Forskellige cellekulturskåle eller et referencenummer tabel 1-1 i en cellekulturskål blev tilsat forkølet 1 x PBS til cellevask.

Tabel 1-1: PBS-dosering for forskellige antal celler

Bemærk:For at sikre en fast klæbende celler，et stort antal celletab undgås ved vask.

1.2.Suspensionsceller eller adhærente celler dyrket i ikke-porøse plader

1.2.1.Vedhæftende celler dyrket i ikke-multibrøndsplader (suspensionsceller starter fra næste trin 1.2.2), opsaml og adskille cellerne i henhold til den normale celleopsamlingsmetode og anbring dem i en kulturplade eller centrifugerør;hvis trypsinisering anvendes, kræve centrifugering for at opsamle cellerne og for at fjerne resterende trypsin, tilsat PBS resuspenderede celler i individuelle celler for at sprede cellerne.

1.2.2.Efter antallet af talte celler, alikvoterede celler 1×10⁵ en for at centrifugere rør, opsaml celler ved centrifugering ved 1000 × g i 10 min.

1.2.3.Tilsæt 200 μl PBS til centrifugerøret, undlad at pipettere gentagne gange, og aspirér PBS direkte.fortsæt til trin 2. (Hvis det er vanskeligt at præcipitere, og cellerne blev resuspenderet igen, kan udføres 1000×g centrifugeret 10 minutter efter at have kasseret supernatanten, fortsætter cellepelleten til trin 2)

2. Cellelyse: Fjern buffer CL, dens temperatur ækvilibreret til stuetemperatur, DNA Eraser og Foregene Protease Plus II i henhold til følgende tabel 1-2 forberedte lyseringssystem: (Lyseopløsning er klar til brug).

Tabel 1-2: spaltning systemforberedelse (Bemærk: i forberedelsen på is)

3.( 24-brønds plade som et eksempel) Pipetter 200 μl cellelysis master mix i hver brønd, blæs gentagne gange 5-10 gange, inkuber ved stuetemperatur (20-25 ℃) i 5 min.

Bemærk:For at undgå dannelse af bobler, skal du venligst justere pipetteskalaen til 200 μl eller mindre, når pipettering.Cellerne kan virke uklare efter lysis, hvilket er normalt.

4.(24-brønds plade som et eksempel) tilsættes i væsken 20 μl Buffer ST (forskellige lyseringssystemer Buffer ST tilsat i en mængde vist i tabel 1-3), gentaget pipettering 5-10 gange, ved stuetemperatur (20-25 ℃) blev inkuberet i 2 min.

Bemærk:Pipettespidsen anbragt under overfladen, hvilket sikrede, at lysatet blev tilsat，for at undgå dannelse af bobler, venligst når pipettering pipette skalaen blev justeret til 200μl eller mindre.

Tabel 1-3:Tilføj buffer ST

5. Lysatet bruges til efterfølgende RT-qPCR-eksperimenter.Hvis de efterfølgende eksperimenter ikke kan udføres i tide, skal du opbevare den på is i højst 2 timer og opbevare den ved -20 ℃ eller -80 ℃ (ikke mere end tre måneder).

B: Klargøring af RT-system

1. Tag 5 × Direct RT Mix ud og læg det på et isbad, lad det smelte naturligt og bland det forsigtigt til senere brug;tag RNase-Free ddH2O ud og smelt det og læg det på et isbad til senere brug.Forbered reaktionssystemet på is i henhold til tabel 2-1 nedenfor.

Tabel 2-1: Forberedelse af RT reaktionssystem

2. Efter afslutning af systemformuleringen blandes forsigtigt og centrifugeres kort i følgende tabel 2-2 reaktionsbetingelser RT-reaktion.

Tabel 2-2: Indstilling af RT-reaktionstilstand

3. Efter afslutningen af ​​reaktionen blev reaktionsproduktet placeret direkte på is til qPCR, læg venligst langtidskonserveringen -20 ℃ eller -80 ℃.

Bemærk: På grund af brugen af ​​ikke-oprenset skabelon kan der forekomme hvide præcipitater i revers transkriptionsproduktet.Dette er et normalt fænomen.Centrifuger supernatanten med det samme til efterfølgende eksperimenter.

Den resulterende RT-reaktionsopløsning tilsættes til næste trin Real-Time PCR-reaktionssystemer, det anbefales at tilføje mængder i området fra 10-30% af reaktionssystemet.

C: forberedelse af qPCR-reaktionssystem

1. Passende mængde af B fremstillet i trin cDNA-skabelon i henhold til følgende tabel 3-1 til fremstilling af et reaktionssystem.

Bemærk: Mængden af ​​cDNA-skabelon udgør 10-30 % af qPCR-systemet.For eksempel, i et 20μl qPCR-system, tilsæt 2-6 μl lysisbuffer, men ikke mere end 6 μl.

2. Optimeringen gode qPCR betingelser (annealing temperatur, etc.) for qPCR reaktion (reaktionsbetingelserne angivet i tabel 3-2).

Bemærk: Prøv at bruge optimerede betingelser for qPCR-reaktioner for at få bedre resultater.

Tabel 3-1: Fremstilling af PCR-reaktionssystem

1*: Primerkoncentrationen kan justeres i området 50-900 nM, når primerreaktionsydelsen er dårlig.

Bemærk: qPCR-systemet kan justeres i henhold til eksperimentelle behov og fluorescenscyklermodel.Til qPCR i en 50μl system, juster reagensdoseringen proportionalt i henhold til 20μl system.

2*: Vælg den passende slutkoncentration af ROX Reference Dye i henhold til den fluorescens kvantitative termiske cyklus.De mest passende ROX-referencefarvekoncentrationer for almindelige kvantitative fluorescenscyklere er vist i tabellen nedenfor:

Tabel 3-2: qPCR-reaktionsbetingelser er angivet

Bemærk: For at opnå den bedste qPCR-effekt kan gradient-PCR bruges til at optimere reaktionsbetingelserne for forskellige skabeloner og forskellige primere.PCR-reaktionsbetingelserne varierer afhængigt af fluorescensanalysatoren, skabelonen, primeren osv. I den specifikke operation skal de optimale reaktionsbetingelser designes i henhold til de specifikke betingelser for den kvantitative fluorescens-termiske cycler, skabelontype, størrelsen af ​​det fragment, der er af interesse, basesekvensen af ​​det amplificerede fragment og GC-indhold og længde af primere, inklusive reaktionstid, osv.

Real Time PCR primer design principper

Forward Primer og Reverse Primer

For Real Time PCR er primerdesign meget vigtigt.Primere er relateret til specificiteten og effektiviteten af ​​PCR-amplifikation og kan designes med henvisning til følgende principper:

◆ Primerlængde: 18-30bp.

◆ GC indhold: 40-60%.

◆ Tm-værdi: Primerdesignsoftware, såsom Primer 5, kan give primerens Tm-værdi.Tm-værdierne for opstrøms- og nedstrømsprimerne skal være så tæt som muligt.Tm-beregningsformlen kan også bruges: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Ved udførelse af PCR vælges generelt en temperatur under primerens Tm-værdi på 5 °C som annealingstemperatur (den tilsvarende stigning i annealingstemperaturen kan øge specificiteten af ​​PCR-reaktionen).

◆ Primere og PCR-produkter:

◆ Design primer PCR amplifikationsproduktlængde er fortrinsvis 100-150 bp.

◆ Designprimere i skabelonens sekundære strukturelle område bør undgås så meget som muligt.

◆ Undgå dannelsen af ​​2 eller flere komplementære baser mellem 3'-enderne af opstrøms- og nedstrømsprimere.

◆ Primer 3′ terminal base kan ikke være til stede med 3 yderligere på hinanden følgende G eller C.

◆ Primerne i sig selv kan ikke have komplementære strukturer, ellers vil der blive dannet en hårnålestruktur, som påvirker PCR-amplifikation.

◆ ATCG bør fordeles så jævnt som muligt i primersekvensen, og den 3′ terminale base bør undgås som T.

bilag1:Celler direkteRT-qPCR Kit komponentt tillægspakke

1. Cellelyseopløsning