Det er velkendt, at i det centrale dogme er RNA den transkriptionelle mediator mellem DNA og proteinekspression.Sammenlignet med påvisning af DNA kan påvisning af RNA mere objektivt afspejle genekspressionen i organismer.Eksperimenter, der involverer RNA, omfatter: qRT-PCR, RNA-Seq og fusionsgendetektion osv. Baseret på egenskaberne af RNA selv (sukkerringen af ​​RNA har en mere fri hydroxylgruppe end sukkerringen af ​​DNA), koblet med et stort antal RNaser i miljøet, er RNA mere ustabilt og lettere at blive nedbrudt end DNA.Skrald ind, skrald ud, hvis kvaliteten af ​​RNA ikke er god, så må de eksperimentelle resultater være utilfredsstillende, specifikt manifesteret som unøjagtige data eller dårlig repeterbarhed.Derfor bør der lægges mere vægt på behandlingen af ​​RNA, og forbindelsen til kvalitetskontrol er også vigtigere for at sikre præcisionen og nøjagtigheden af ​​efterfølgende eksperimentelle data.

Til kvalitetskontrol af RNA er der generelt følgende almindeligt anvendte metoder:

• Spektrofotometri
• agarosegelelektroforese
• Agilent Bioanalyzer
• real-time fluorescerende kvantitativ PCR
• Qubit fluorescerende farvemetode

01 Spektrofotometri

RNA har konjugerede dobbeltbindinger og har en absorptionstop ved en bølgelængde på 260 nm.Ifølge Lambert-Beers lov kan vi beregne RNA-koncentrationen ud fra absorptionstoppen ved 260nm.Derudover kan vi også beregne renheden af ​​RNA i henhold til forholdet mellem 260nm, 280nm og 230nm absorptionstoppe.280nm og 230nm er absorptionstoppene for henholdsvis proteiner og små molekyler.Forholdet mellem A260/A280 og A260/A230 af kvalificeret RNA-renhed bør være større end 2. Hvis det er mindre end 2, betyder det, at der er protein- eller småmolekylekontamination i RNA-prøven og skal renses igen.Kontamineringskilder vil påvirke nedstrøms eksperimenter, såsom hæmning af amplifikationseffektiviteten af ​​PCR-reaktioner, hvilket resulterer i unøjagtige kvantitative resultater.Renheden af ​​RNA har stor indflydelse på efterfølgende resultater, så spektrofotometri er generelt et uundværligt kvalitetskontrolled i det første trin i nukleinsyreforsøg.

Figur 1. Typisk RNA/DNA-absorptionsspektrum

02 Agarosegelelektroforese

Ud over renhed er RNA's integritet også en af ​​de vigtige indikatorer for at bedømme kvaliteten af ​​RNA.Nedbrydningen af ​​RNA vil føre til et stort antal korte fragmenter i prøven, så antallet af RNA-fragmenter, der effektivt kan påvises og dækkes af referencesekvensen, vil blive reduceret.RNA-integritet kan kontrolleres ved elektroforese af totalt RNA på en 1% agarosegel.Denne metode kan konfigurere gelen selv eller bruge det præfabrikerede E-Gel™-system til integritetstestning.Mere end 80 % af det samlede RNA er ribosomalt RNA, hvoraf størstedelen er sammensat af 28S og 18S rRNA (i pattedyrsystemer).RNA af god kvalitet vil vise to tydelige lyse søjler, som er henholdsvis 28S og 18S lyse søjler ved 5 Kb og 2 Kb, og forholdet vil have en tendens til at være tæt på 2:1.Hvis det er i en diffus tilstand, betyder det, at RNA-prøven kan være blevet nedbrudt, og det anbefales at bruge metoden beskrevet senere for yderligere at teste kvaliteten af ​​RNA.

Figur 2. Sammenligning af nedbrudt (bane 2) og intakt RNA (bane 3) på agarosegelelektroforese

03 Agilent Bioanalyzer

Ud over agarosegelelektroforesemetoden beskrevet ovenfor, som kan hjælpe os med at identificere integriteten af ​​RNA enkelt og hurtigt, kan vi også bruge Agilent bioanalyzeren til at bestemme integriteten af ​​RNA.Den bruger en kombination af mikrofluidik, kapillærelektroforese og fluorescens til at vurdere RNA-koncentration og integritet.Ved at bruge den indbyggede algoritme til at analysere profilen af ​​RNA-prøven, kan Agilent-bioanalyzeren beregne en reference-RNA-integritetsværdi, RNA-integritetsnummer (herefter benævnt RIN) [1].Jo større værdien af ​​RIN er, jo højere er integriteten af ​​RNA'et (1 er ekstremt nedbrudt, 10 er det mest komplette).Nogle eksperimenter, der involverer RNA, foreslår at bruge RIN som en parameter til kvalitetsvurdering.Ved at tage high-throughput sekventeringseksperimenter (herefter benævnt NGS) som et eksempel, tyder retningslinjerne for Oncomine™ Human Immune Repertoire, som bruges til at detektere B-celle- og T-celle-antigenreceptorer i Thermo Fishers Oncomine-panelserie, at prøver med RIN-værdier større end 4, Mere effektive aflæsninger og kloninger kan måles og klones.Der er forskellige anbefalede intervaller for forskellige paneler, og ofte kan en højere RIN give mere effektive data.

Figur 3, i Oncomine™ Human Immune Repertoire-eksperimenter, kan prøver med RIN større end 4 detektere mere effektive aflæsninger og T-cellekloner.【2】

RIN-værdien har dog også nogle begrænsninger.Selvom RIN har en høj korrelation med kvaliteten af ​​NGS-eksperimentelle data, er den ikke egnet til FFPE-prøver.FFPE-prøver er blevet kemisk behandlet i lang tid, og det ekstraherede RNA har generelt en relativt lav RIN-værdi.Dette betyder dog ikke, at forsøgets effektive data skal være utilfredsstillende.For nøjagtigt at vurdere kvaliteten af ​​FFPE-prøver skal vi bruge andre mål end RIN.Udover RIN kan Agilent bioanalyzer også beregne DV200-værdien som en evalueringsparameter for RNA-kvalitet.DV200 er en parameter, der beregner andelen af ​​fragmenter større end 200 bp i en RNA-prøve.DV200 er en bedre indikator for FFPE-prøvekvalitet end RIN.For RNA ekstraheret af FFPE har det en meget høj korrelation med antallet af gener, der effektivt kan påvises, og diversiteten af ​​gener [3].Selvom DV200 kan kompensere for manglerne i kvalitetsdetektionen af ​​FFPE, kan Agilent bioanalyzer stadig ikke analysere kvalitetsproblemerne i RNA-prøver, herunder om der er inhibitorer i prøverne.Inhibitorer selv kan påvirke amplifikationseffektiviteten af ​​downstream-eksperimenter og reducere mængden af ​​nyttige data.For at vide, om der er en inhibitor i prøven, kan vi anvende real-time fluorescerende kvantitative PCR-metoden beskrevet næste.

04 real-time fluorescerende kvantitativ PCR

Den fluorescerende kvantitative PCR-metode i realtid kan ikke kun detektere inhibitorerne i prøven, men afspejler også nøjagtigt kvaliteten af ​​RNA i FFPE-prøven.Sammenlignet med Agilent biologiske analysatorer er kvantitative fluorescensinstrumenter i realtid mere populære i større biologiske laboratorier på grund af deres bredere anvendelse.For at teste kvaliteten af ​​RNA-prøver behøver vi kun at købe eller forberede primerprober til interne referencegener, såsom GUSB (kat. nr. Hs00939627).Ved at bruge dette sæt af primere, prober og standarder (total RNA af kendt koncentration) til at udføre absolutte kvantitative eksperimenter, kan den effektive RNA-fragmentkoncentration beregnes som evalueringsstandarden for RNA-kvalitet (Functional RNA Quantitation (FRQ) for kort).I en NGS-test fandt vi, at FRQ af RNA-prøver har en meget høj korrelation med den effektive datavolumen.For alle prøver, der er større end 0,2 ng/uL FRQ, kan mindst 70 % af aflæsningerne effektivt dække referencesekvensen (figur 4).

Figur 4 har FRQ-værdien påvist ved den kvantitative fluorescensmetode en meget høj korrelation (R2>0,9) med de effektive data opnået i NGS-eksperimentet.Den røde linje er FRQ-værdien lig med 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Ud over at være anvendelig til FFPE-prøver, kan real-time kvantitative PCR-metoden også effektivt overvåge inhibitorer i prøver.Vi kan tilføje prøven, der skal påvises, i reaktionssystemet med Internal Positive Control (IPC) og dets assay og derefter udføre fluorescenskvantificering for at opnå Ct-værdien.Hvis Ct-værdien halter efter Ct-værdien i reaktionen uden prøve, indikerer det, at inhibitoren er til stede i prøven og hæmmer amplifikationseffektiviteten i reaktionen.

05 Qubit fluorescerende farvemetode

Qubit Fluorometer er den mest almindeligt anvendte lille enhed til påvisning af nukleinsyrekoncentration og renhed, som er nem at betjene og findes i næsten alle molekylærbiologiske laboratorier.Den beregner nøjagtigt koncentrationen af ​​nukleinsyre ved at detektere og nukleinsyrebindende fluorescerende farvestof (Qubit detektionsreagens).Qubit har høj sensitivitet og specificitet og kan nøjagtigt kvantificere RNA ned til pg/µL koncentration.Ud over den velkendte evne til præcist at kvantificere nukleinsyrekoncentrationen, kan Thermo Fishers seneste nye model, Qubit 4.0, også detektere integriteten af ​​RNA.Qubit 4.0's RNA-detektionssystem (RNA IQ Assay) detekterer integriteten af ​​RNA ved samtidig at detektere to specifikke fluorescerende farvestoffer.Disse to fluorescerende farvestoffer kan binde til henholdsvis store fragmenter og små fragmenter af RNA.Disse to fluorescerende farvestoffer angiver andelen af ​​store fragmenter af RNA i prøven, og ud fra denne kan IQ-værdien (integritet og kvalitet), der repræsenterer RNA-kvaliteten, beregnes.IQ-værdien gælder for både FFPE og ikke-FFPE prøver og har stor indflydelse på den efterfølgende sekventeringskvalitet.Tager man NGS-eksperimenter som eksempel, i RNA-Seq-testeksperimenterne udført på Ion torrent™-platformen, havde de fleste prøver med IQ-værdier større end 4 mindst 50 % effektive aflæsninger (figur 5).Sammenlignet med de ovennævnte detektionsmetoder er Qubit IQ Assay ikke kun mere praktisk at betjene og tager mindre tid (inden for fem minutter), men har også en stor sammenhæng mellem den målte parameter IQ-værdi og datakvaliteten af ​​downstream-eksperimenter.

Figur 5 er der en stor sammenhæng mellem Qubit RNA IQ-værdien og de kortlagte læsninger af RNA-Seq.【5】

Gennem ovenstående introduktion mener jeg, at alle har en tilstrækkelig forståelse for forskellige RNA kvalitetskontrol metoder.I praksis kan du vælgeden tilsvarende metode i henhold til prøvetypen og eksisterende instrumenter.Kun ved at kontrollere kvaliteten af ​​RNA godt kan vi undgå fejl i efterfølgende eksperimenter forårsaget af dårlig prøvekvalitet og dermed spare kostbar tid, energi og omkostninger.

Referenceprodukter:

Animal Total RNA Isolation Kit

Cell Total RNA Isolation Kit

referencer

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: et RNA-integritetsnummer til at tildele integritetsværdier til RNA-målinger.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Brugervejledning til Oncomine Human Immune Repertoire (Pub. Nr. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 3–7, August 20e, 3, 7, 20, 170, 3.https://doi.org/10.1093/toxsci/