RT-qPCR-eksperiment inkluderer RNA-ekstraktion og kvalitetsvurdering, omvendt transkription og qPCR tre trin, hvert trin har en masse forholdsregler, vi vil introducere i detaljer nedenfor.

Ⅰ.RNA kvalitetsvurdering

I RT-qPCR-eksperimentet, efter afslutningen af ​​RNA-ekstraktion, skal kvaliteten af ​​RNA evalueres, og opfølgningsforsøget kan kun udføres, efter at det er kvalificeret.Evalueringsmetoder omfatter spektrofotometer, Agilent gelelektroforese, Agilent 2100 analyse, blandt hvilke det mest almindeligt anvendte spektrofotometer og agarosegelelektroforesemetodedetektion.Det skal bemærkes, at disse to metoder skal bruges sammen for at fuldføre påvisning og analyse af RNA-koncentration, renhed og integritet for at sikre kvaliteten af ​​RNA.

Relateret RNA-isoleringssæt: 

Cell Total RNA Isolation Kit

Højt oprenset og højkvalitets total RNA kan opnås fra forskellige dyrkede celler på 11 min.

Animal Total RNA Isolation Kit

Hurtigt og effektivt ekstraherer total-RNA af høj renhed og høj kvalitet fra forskellige dyrevæv.

Spektrofotometer:

Spektrofotometeret bruges hovedsageligt til at bestemme koncentrationen og renheden af ​​RNA, men det kan ikke påvise integriteten af ​​RNA og genomiske rester.Blandt dem er A260/280 og A260/230 vigtige parametre til påvisning af RNA-renhed, og RNA-renhed kan påvises i henhold til udsving i deres værdier:

1. 1,9< A260/280< 2,1, hvilket indikerer, at RNA-renheden er god;A260/280<1,9, hvilket indikerer, at der kan være proteinrest i RNA;A260/280>2.1, hvilket indikerer mulig delvis nedbrydning af RNA, hvilket yderligere kan bekræftes ved agarosegelelektroforese.

2. 2,0< A260/230< 2,2, hvilket indikerer, at RNA-renheden er god;A260/230< 2,0, hvilket indikerer, at der kan være rester af organiske reagenser i RNA, såsom phenoler, ethanol eller sukkerarter.

Agarosegelelektroforese:

Agarosegelelektroforeseassay kan analysere RNA-integritet, genom- og proteinrester, men kan ikke nøjagtigt kvantificere koncentrationen af ​​RNA eller detektere resterne af organiske reagenser.Tag for eksempel eukaryote RNA-skabeloner:

1. RNA'et blev udsat for agarosegelelektroforese.Hvis der kun var tre enkelte bånd af 28sRNA, 18sRNA og 5.8sRNA på gelkortet, indikerer det, at det ekstraherede RNA er intakt.Hvis der er et trækkende fænomen, indikerer det delvis nedbrydning af RNA.

2. Hvis der er et enkelt lyst bånd mellem limhullet og 28sRNA-båndet, kan der være genomisk DNA-rest.

3. Hvis der kommer bånd i limhullet, indikerer det, at der kan være rester af protein og andre makromolekylære stoffer.

Ⅱ. Omvendt transskription

Efter RNA-ekstraktion er afsluttet, skal det vendes til cDNA til efterfølgende eksperimenter, så vendingstrinnet er vigtigt.Revers transkription vil blive introduceret fra udvælgelsen af ​​revers transkriptase og primer:

Valg af omvendt transkriptase:

De typiske reverse transkriptaser inkluderer AMV RTase og MMLV RTase.RNase H af AMV RTase har stærk aktivitet, kort synteselængde, lav syntesemængde og god termisk stabilitet (42 ~ 55 ℃).RNase H-aktiviteten af ​​MMLV RTase er svag, synteselængden er lang, syntesemængden er høj, og den termiske stabilitet er dårlig (37 ~ 42 ℃).

Fordi RNase H-enzym har funktionen at nedbryde RNA-skabelon, bør MMLV med svag RNase H-aktivitet fortrinsvis vælges under revers transkription, og efter senere genteknologi har den termiske stabilitet af MMLV nået et kvalitativt spring.Tager ForegeneForeasy omvendt transkriptase (M-MLV til omvendt transkription) som et eksempel er det en ny revers transkriptase udtrykt i E. coli-konstruerede bakterier ved hjælp af genetisk rekombinationsteknologi.Det er en rekombinant DNA-polymerase, der syntetiserer en komplementær DNA-streng fra enkeltstrenget RNA, DNA eller en RNA:DNA-hybrid.Det har ingen RNase H-aktivitet, stærk stabilitet, stærk RNA-affinitet og høj detektionsfølsomhed.

 

Foreasy omvendt transkriptase (M-MLV til omvendt transkription)

Valg af primer:

Generelt falder RT-primere i tre kategorier: oligo-dT, tilfældige primere og genspecifikke primere.Vælg passende primere til brug i henhold til forskellige eksperimentelle krav.

1. Hvis skabelonen er af eukaryot oprindelse, og det sene cDNA anvendes til rutinemæssig PCR-amplifikation, anbefales Oligo (dT);Hvis det efterfølgende eksperiment kun bruges til qPCR, anbefales det at Oligo (dT) blandes med tilfældige primere for at forbedre effektiviteten af ​​revers transkription.

2. Hvis skabelonen er fra prokaryoter, skal tilfældige primere eller genspecifikke primere vælges til revers transkription.

Ⅲ.qPCR

Fluorescens kvantificering er hovedsageligt udarbejdet ud fra udvælgelsen af ​​kvantitative metoder, primerdesignprincipper, ROX-valg, reaktionssystemkonfiguration og indstilling af reaktionsbetingelser osv.

Valg af kvantitative metoder:

Kvantitative metoder er opdelt i relative kvantitative metoder og absolut kvantitative metoder.Relativ kvantificering kan bruges til at påvise effekten af ​​visse behandlingsmetoder på genekspression, påvise forskellen i genekspression på forskellige tidspunkter og sammenligne forskellen på genekspression i forskellige væv.Absolut kvantificering kan påvise mængden af ​​nukleinsyre i virussen og så videre.Når vi laver forsøg, skal vi vælge de passende kvantitative metoder i henhold til vores egne eksperimenter.

Primer design principper:

Designet af primeren til qPCR er direkte relateret til amplifikationseffektiviteten og produktspecificiteten.Derfor er korrekt design af gode primere det første trin i vellykket qPCR.Ved design af primer skal følgende principper være opmærksomme, når princippet om konventionelt primerdesign overholdes:

1. Længden af ​​målfragmentet kontrolleres mellem 100 og 300 bp;

2. Cross-exon design for at undgå påvirkning af genomisk DNA;

3. De designede primere skal testes for amplifikationseffektivitet, og kun når amplifikationseffektiviteten når standarden (90-110%), kan de bruges til kvantitative eksperimenter;

4. Primerkoncentration er normalt optimeret mellem 0,1 uM og 1,0 uM.

Udvalg afROX:

I processen med kvantitativ reaktion kan ROX justere den optiske vejforskel, pipetteringsfejl eller volumenforskel forårsaget af fordampning og kondensering ensartet, hvilket forbedrer resultaternes repeterbarhed.Det skal dog bemærkes, at valget af ROX er relateret til instrumentet.Hvis qPCR-instrumentet har funktionen til automatisk at korrigere forskellen mellem huller, behøver det ikke at tilføje ROX;ellers skal den tilføje ROX-korrektion.Små partnere til at købe reagenser skal være i overensstemmelse med det instrument, der bruges til at vælge den korrekte ROX, undgå senere fejl.

Forberedelse af reaktionssystem:

Reaktionsvolumener på 20 µl og 50 µl foretrækkes.Følgende forhold skal være opmærksomme på, når systemet udformes:

1. Reaktionssystemet skal klargøres ved ventilation i det ultra-rene arbejdsbord, ny ddH₂O bruges til hvert eksperiment;

2. Hvert eksperiment skal forberede NTC for at verificere, om der er forurening i systemet, og hvert par primere skal udføre NTC, når systemet forberedes;

3. For at påvise, om der er gDNA-rest i RNA-skabelonen, kan NRT fremstilles for hver prøve til påvisning;

4. Ved klargøring af systemet anbefales det at udføre mindst 3 tekniske gentagelser for én prøve;

5. Når skabelonen er cDNA, anbefales det at fortynde 5-10 gange for at reducere hæmningseffekten af ​​revers transkriptionssystem på qPCR-eksperiment.Det er bedre at udforske skabelonmængden efter gradient, så CT-værdien falder mellem 20-30;

6. Bestem det nødvendige antal reaktioner, øg med 5-10% på basis af antallet af reaktioner, og beregn volumenkonfigurationstallet;

7, systemet er forberedt ved hjælp af premix-princippet, blanding efter centrifugering og sikre ingen bobler;

8, så vidt muligt at vælge understøttende forbrugsstoffer.

Relateret RT-qPCR-sæt