Fluorescens kvantitativ PCR (også kendt som TaqMan PCR, i det følgende benævnt FQ-PCR) er en ny kvantitativ nukleinsyreteknologi udviklet af PE (Perkin Elmer) i USA i 1995. Denne teknologi er baseret på konventionel PCR ved at tilføje fluorescerende mærkede prober.Sammenlignet med fleksibel PCR har FQ-PCR mange fordele til at realisere sin kvantitative funktion.Denne artikel har til hensigt kort at beskrive teknologiens karakteristika, principper, metoder og anvendelser.
1 funktioner
FQ-PCR har ikke kun den høje følsomhed af almindelig PCR, men også på grund af anvendelsen af fluorescerende prober, kan den direkte detektere ændringen af fluorescerende signal under PCR-amplifikation gennem det fotoelektriske ledningssystem for at opnå kvantitative resultater, som overvinder mange mangler ved konventionel PCR, så det har også den høje specificitet af DNA-hybridisering og høj specificitet af DNA-teknologi.
For eksempel skal generelle PCR-produkter observeres ved agarosegelelektroforese og ethidiumbromidfarvning med ultraviolet lys eller ved polyacrylamidgelelektroforese og sølvfarvning.Dette kræver ikke kun flere instrumenter, men kræver også tid og kræfter.De anvendte pletter Ethidiumbromid er skadelige for den menneskelige krop, og disse komplicerede eksperimentelle procedurer giver muligheder for forurening og falske positiver.FQ-PCR behøver dog kun at åbne låget én gang under prøveindlæsning, og den efterfølgende proces er fuldstændig lukket røroperation, som ikke kræver PCR-efterbehandling, hvilket undgår mange ulemper ved konventionelle PCR-operationer.Eksperimentet bruger generelt ABI7100 PCR termisk cykler udviklet af PE-firmaet.
Instrumentet har følgende egenskaber: ① Bred anvendelse: Det kan bruges til DNA- og RNA PCR-produktkvantificering, genekspressionsforskning, patogendetektion og optimering af PCR-betingelser.② Unikt kvantitativt princip: Ved brug af fluorescensmærkede prober vil mængden af fluorescens akkumuleres med PCR-cyklussen efter laserexcitation for at opnå formålet med kvantificering.③ Høj arbejdseffektivitet: Indbygget 9600 PCR termisk cykler, computerstyret 1 til 2 timer for at fuldføre amplifikationen og kvantificeringen af 96 prøver automatisk og synkront.④ Intet behov for gelelektroforese: Ingen grund til at fortynde og elektroforese prøven, brug blot en speciel sonde til at detektere direkte i reaktionsrøret.⑤Ingen forurening i rørledningen: Det unikke fuldt lukkede reaktionsrør og fotoelektriske ledningssystem er vedtaget, så der er ingen grund til at bekymre sig om forurening.⑥Resultaterne er reproducerbare: Det kvantitative dynamiske område er op til fem størrelsesordener.Derfor, siden denne teknologi blev udviklet med succes, er den blevet værdsat af mange videnskabelige forskere og er blevet anvendt på mange områder.
2 Principper og metoder
Arbejdsprincippet for FQ-PCR er at bruge 5′→3′ exonukleaseaktiviteten af Taq enzym til at tilføje en fluorescensmærket probe til PCR-reaktionssystemet.Proben kan specifikt hybridisere med DNA-skabelonen indeholdt i primersekvensen.5'-enden af proben er mærket med fluorescens-emissionsgenet FAM (6-carboxyfluorescein, fluorescensemissionstop ved 518 nm), og 3'-enden er mærket med fluorescensdæmpningsgruppen TAMRA (6-carboxytetramethyl-peakrhodamin, 5-carboxytetramethyl-peakrhodamin, 5-carboxytetramethylpeakrhodence, 5'2'en 518nm), egrening af proben phosphoryleres for at forhindre proben i at blive forlænget under PCR-amplifikation.Når proben forbliver intakt, undertrykker quencher-gruppen fluorescensemissionen fra den emitterende gruppe.Når den emitterende gruppe er adskilt fra quenching-gruppen, ophæves inhiberingen, og den optiske tæthed ved 518nm øges og detekteres af fluorescensdetektionssystemet.I renatureringsfasen hybridiserer proben med template-DNA'et, og Taq-enzymet i forlængelsesfasen bevæger sig langs DNA-skabelonen med forlængelsen af primeren.Når proben afskæres, frigives den quenching-effekt, og det fluorescerende signal frigives.Hver gang skabelonen kopieres, skæres en probe af, ledsaget af frigivelsen af et fluorescerende signal.Da der er et en-til-en forhold mellem antallet af frigivne fluoroforer og antallet af PCR-produkter, kan denne teknik bruges til nøjagtigt at kvantificere skabelonen.Det eksperimentelle instrument bruger generelt ABI7100 PCR termisk cykler udviklet af PE firmaet, og andre termiske cyklere kan også bruges.Hvis reaktionssystemet ABI7700 anvendes til eksperimentet, kan de kvantitative resultater, efter at reaktionen er afsluttet, gives direkte gennem computeranalyse.Hvis du bruger andre termiske cyklere, skal du bruge en fluorescensdetektor til at måle fluorescenssignalet i reaktionsrøret på samme tid for at beregne RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ repræsenterer forholdet mellem luminescensintensiteten af fluorescens-emissionsgruppen i prøverøret og luminescensintensiteten af quenching-gruppen, RQ- repræsenterer forholdet mellem de to i det tomme rør, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) repræsenterer mængden af dataændring under fluorescensprocessen opnået efter PCR-processen.På grund af indførelsen af fluorescerende prober er specificiteten af eksperimentet væsentligt forbedret.Probedesignet bør generelt opfylde følgende betingelser: ①Probens længde skal være omkring 20-40 baser for at sikre bindingsspecificiteten.②Indholdet af GC-baser er mellem 40% og 60% for at undgå duplikering af enkelte nukleotidsekvenser.③ Undgå hybridisering eller overlapning med primere.④ Stabiliteten af bindingen mellem proben og skabelonen er større end stabiliteten af bindingen mellem primeren og skabelonen, så Tm-værdien af proben bør være mindst 5°C højere end Tm-værdien af primeren.Derudover har koncentrationen af proben, homologien mellem proben og skabelonsekvensen og afstanden mellem proben og primeren alle en indflydelse på de eksperimentelle resultater.
Relaterede produkter:
Kina Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman producent og leverandør |Foregene (foreivd.com)
Indlægstid: 15. oktober 2021
