Primer design basis (99% problemer kan løses)
1. Primerlængde: Lærebogen kræver 15-30bp, normalt omkring 20bp.Den faktiske tilstand er bedre at være 18-24bp for at sikre specificiteten, men jo længere jo bedre, for lang primer vil også reducere specificiteten og reducere udbyttet.
2. Primer-amplifikationsspændvidde: 200-500 bp er passende, og fragmentet kan udvides til 10 kb under specifikke betingelser.
3. Primer base: Indholdet af G+C skal være 40-60%, for lidt G+C amplifikationseffekt er ikke god, for meget G+C er let at fremstå uspecifikke bånd.ATGC fordeles bedst tilfældigt, idet man undgår klynger af mere end 5 purin- eller pyrimidinnukleotider.Multi-gc for 5'-enden og mellemsekvenser for at øge stabiliteten, undgå rig GC i 3'-enden, ingen GC for de sidste 3 baser eller ingen GC for 3 af de sidste 5 baser.
4. Undgå sekundær struktur i primere, og undgå komplementering mellem to primere, især komplementering i 3'-enden, ellers vil der dannes primerdimer og dannes ikke-specifikke amplificerede bånd.
5. Baserne i 3'-enden af primerne, især de sidste og næstsidste baser, bør være strengt parret for at undgå PCR-fejl på grund af uparrede terminale baser.
6. Primere har eller kan tilføjes med passende spaltningssteder, og den amplificerede målsekvens skal fortrinsvis have passende spaltningssteder, hvilket er meget fordelagtigt til spaltningsanalyse eller molekylær kloning.
7. Specificitet af primere: primere bør ikke have nogen åbenlys homologi med andre sekvenser i nukleinsyresekvensdatabasen.
8. Lær at bruge software: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Dette online design fungerer bedst).
Ovenstående indhold kan løse mindst 99 % af primerdesignproblemerne.
Styr detaljerne i primerdesign
1. Primer længde
Generel primerlængde er 18~30 baser.Generelt er den vigtigste faktor, der bestemmer annealingstemperaturen af primeren, længden af primeren.Udglødningstemperaturen for primeren vælges generelt (Tm-værdi -5℃), og nogle bruger direkte Tm-værdi.Følgende formler kan bruges til groft at beregne annealingstemperaturen for primere.
Når længden af primeren er mindre end 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Når primerens længde er større end 20bp: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/længde-5℃
Derudover kan mange software også bruges til at beregne udglødningstemperaturen, beregningsprincippet vil være anderledes, så nogle gange kan den beregnede værdi have et lille hul.For at optimere PCR-reaktioner bruges de korteste primere, der sikrer annealingstemperaturer på ikke mindre end 54 ℃ for den bedste effektivitet og specificitet.
Overordnet stiger primerspecificiteten med en faktor fire for hvert yderligere nukleotid, således at den minimale primerlængde for de fleste anvendelser er 18 nukleotider.Den øvre grænse for primerlængde er ikke særlig vigtig, primært relateret til reaktionseffektivitet.På grund af entropi, jo længere primeren er, desto lavere er den hastighed, hvormed den annealer for at binde til mål-DNA'et for at danne en stabil dobbeltstrenget skabelon for DNA-polymerase til at binde.
Når der bruges software til at designe primere, kan længden af primere bestemmes ved TM-værdi igen, især for primere af fluorescens kvantitativ PCR, bør TM=60℃ eller deromkring kontrolleres.
2.GC indhold
Generelt er indholdet af G+C i primersekvenser 40%~60%, og GC-indhold og Tm-værdi for et par primere bør koordineres.Hvis primeren har en alvorlig GC- eller AT-tendens, kan passende mængder af A, T eller G og C hale tilsættes til 5'-enden af primeren.
3. Udglødningstemperatur
Udglødningstemperaturen skal være 5 ℃ lavere end kædetemperaturen.Hvis antallet af primerbaser er lille, kan annealingstemperaturen øges passende, hvilket kan øge specificiteten af PCR.Hvis antallet af baser er stort, kan udglødningstemperaturen reduceres passende.Udglødningstemperaturforskellen mellem et par primere på 4 ℃ ~ 6 ℃ vil ikke påvirke PCR-udbyttet, men ideelt set er annealingstemperaturen for et par primere den samme, som kan variere mellem 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Undgå det sekundære strukturområde af amplifikationsskabelonen
Det er bedst at undgå den sekundære strukturregion af skabelonen, når du vælger det amplificerede fragment.Den stabile sekundære struktur af målfragmentet kan forudsiges og estimeres af relevant computersoftware, hvilket er nyttigt til skabelonvalg.Eksperimentelle resultater viser, at ekspansionen ofte er mislykket, når den frie energi (△G) i regionen, der skal udvides, er mindre end 58,6 lkJ/mol.
5. Mismatch med mål-DNA
Når den amplificerede mål-DNA-sekvens er stor, kan en primer binde til flere dele af mål-DNA'et, hvilket resulterer i, at der vises flere bånd i resultatet.Denne gang er det nødvendigt at bruge BLAST softwaretest, hjemmeside:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Vælg Juster to sekvenser (bl2seq).
Indsættelse af primersekvenser til zone 1 og mål-DNA-sekvenser til zone 2 kan udskiftes, og BLAST beregner komplementære, antisense og andre muligheder, så brugerne ikke behøver at bemærke, om begge kæder er sense-kæder.Du kan også indtaste GI-nummeret, hvis du kender GI-nummeret på sekvensen i databasen, så du ikke skal indsætte en stor del af sekvensen.Til sidst skal du klikke på Juster ved 3 for at se, om primeren har flere homologe steder i mål-DNA'et.
6. Primerterminal
3'-enden af primeren er der, hvor forlængelsen begynder, så det er vigtigt at forhindre, at mismatches starter der.3'-enden bør ikke være mere end 3 på hinanden følgende G eller C, fordi dette vil forårsage, at primeren ved en fejl trigges i G+C-berigelsessekvensregionen.3'-enden kan ikke danne nogen sekundær struktur, undtagen i specielle PCR (AS-PCR)-reaktioner, kan 3'-enden af primeren ikke mismatches.Hvis f.eks. den kodende region amplificeres, bør 3'-enden af primeren ikke termineres ved den tredje position af codon, fordi den tredje position af codon er tilbøjelig til at degenerere, hvilket vil påvirke specificiteten og effektiviteten af amplifikation.Når du bruger annekteringsprimere, henvises til tabellen for kodonbrug, vær opmærksom på biologiske præferencer, brug ikke annekteringsprimere i 3′-enden og brug en højere koncentration af primere (1uM-3uM).
7. Sekundær struktur af primere
Primerne i sig selv bør ikke have komplementære sekvenser, ellers vil primerne selv foldes til hårnålestrukturer, og denne sekundære struktur vil påvirke bindingen af primere og skabeloner på grund af sterisk hindring.Hvis der anvendes kunstig bedømmelse, bør de kontinuerlige komplementære baser af selve primerne ikke være større end 3 bp.Der bør ikke være nogen komplementaritet mellem de to primere, især den komplementære overlapning af 3'-enden bør undgås for at forhindre dannelsen af primerdimere.Generelt bør der ikke være mere end 4 på hinanden følgende baser homologi eller komplementaritet mellem et par primere.
8. Tilføj markører eller loci
5'-enden har ringe effekt på amplifikationsspecificiteten og kan derfor modificeres uden at påvirke amplifikationsspecificiteten.Modifikationen af primer 5'-enden omfattede: tilføjelse af enzymrestriktionssted;Mærket biotin, fluorescens, digoxin, Eu3+ osv. Introducer proteinbindende DNA-sekvenser;Introduktion af mutationssteder, indsættelse og manglende mutationssekvenser og introduktion af promotorsekvenser osv. De ekstra baser vil mere eller mindre påvirke effektiviteten af amplifikationen og øge chancen for primer-dimer-dannelse, men der skal gives nogle indrømmelser til næste trin.Yderligere sekvenser, der ikke eksisterer på målsekvensen, såsom restriktionssteder og promotorsekvenser, kan tilføjes til 5'-enden af primeren uden at påvirke specificiteten.Disse sekvenser er ikke inkluderet i beregningen af primer Tm-værdier, men bør testes for komplementaritet og intern sekundær struktur.
9. Subkloner
Det meste af tiden er PCR kun foreløbig kloning, og så skal vi subklone målfragmentet i forskellige vektorer, så vi skal designe yderligere baser til den næste operation i PCR-trinnet.
Nogle sekvenser designet til subkloning er opsummeret nedenfor.
Restriktionsendonuklease-restriktionssted blev tilføjet
Tilføjelse af enzymrestriktionssteder er den mest almindeligt anvendte metode til subkloning af PCR-produkter.Generelt er spaltningsstedet seks baser, ud over 5'-enden af spaltningsstedet skal der tilføjes 2 ~ 3 beskyttende baser.Imidlertid er antallet af beskyttende baser, der kræves af forskellige enzymer, forskelligt.For eksempel kræver SalⅠ ingen beskyttende base, EcoRⅤ kræver 1 beskyttende base, NotⅠ kræver 2 beskyttende baser, og Hind Ⅲ kræver 3 beskyttende baser.
LIC tilføjer halen
Det fulde navn på LIC er Ligation-Independent cloning, en kloningsmetode opfundet af Navogen specifikt for dens del af pET-vektoren.pET-bæreren fremstillet ved LIC-metoden har ikke-komplementære 12-15 baser enkeltstrengede klæbrige ender, som komplementerer de tilsvarende klæbrige ender på målindsættelsesfragmentet.Til amplifikationsformål bør primer 5'-sekvensen af det indsatte fragment komplementere LIC-vektoren.3′→5′ ekstranect-aktiviteten af T4 DNA-polymerase kan danne en enkeltstrenget klæbrig ende på det indsatte fragment efter kort tid.Fordi produktet kun kan dannes ud fra den gensidige annealing af det forberedte insertfragment og vektoren, er denne metode meget hurtig og effektiv, og den er rettet kloning.
Direkte TA klon tilføje hale
TA-kloning var ikke i stand til at målrette fragmentet ind i en vektor, så senere introducerede Invitrogen en vektor, der kunne målrette kloning, som indeholdt fire fremtrædende base GTGGS i den ene ende.Ved udformningen af PCR-primere bør komplementære sekvenser derfor tilføjes i overensstemmelse hermed, så fragmenter kan "orienteres".
Hvis du mangler tid, kan du prøve direkte syntese ved at kombinere genet med vektoren, som er det, vi kalder ET-gensyntese hos musekulære.
D. In-Fusion kloningsmetode
Ingen ligase påkrævet, ingen lang reaktion påkrævet.Så længe der indføres en sekvens i begge ender af den lineariserede vektor. I design af primere, så tilføjes PCR-produktet og den lineariserede vektor til infusionsenzymopløsningen indeholdende BSA og placeres ved stuetemperatur i en halv time, transformationen kan udføres.Denne metode er særligt velegnet til konvertering af store mængder.
10. Merge primer
Nogle gange kendes kun begrænset sekvensinformation om primerdesign.For eksempel, hvis kun aminosyresekvensen er kendt, kan den sammensmeltende primer designes.En fusionsprimer er en blanding af forskellige sekvenser, der repræsenterer alle de forskellige basemuligheder, der koder for en enkelt aminosyre.For at øge specificiteten kan du henvise til kodonanvendelsestabellen for at reducere annektering i henhold til basebrugspræferencer for forskellige organismer.Hypoxanthin kan parres med alle baserne for at reducere primerens annealingstemperatur.Brug ikke de annekserede baser i 3'-enden af primeren, da annealingen af de sidste 3 baser i 3'-enden er tilstrækkelig til at starte PCR på det forkerte sted.Højere primerkoncentrationer (1μM til 3μM) anvendes, fordi primere i mange annekteringsblandinger ikke er specifikke for målskabelonen.
PCR råvarerstyring
1. Primer mængde
Koncentrationen af hver primer er 0,1 ~ 1 umol eller 10 ~ 100 pmol.Det er bedre at producere det ønskede resultat med den laveste mængde primer.Høj koncentration af primer vil forårsage mismatch og ikke-specifik amplifikation og øge chancen for at danne dimerer mellem primere.
2. Primerkoncentration
Koncentrationen af primere påvirker specificiteten.Den optimale primerkoncentration er generelt mellem 0,1 og 0,5μM.Højere primerkoncentrationer fører til amplifikation af uspecifikke produkter.
3. Udglødningstemperatur af primer
En anden vigtig parameter for primere er smeltetemperaturen (Tm).Dette er temperaturen, når 50 % af primerne og komplementære sekvenser er repræsenteret som dobbeltstrengede DNA-molekyler.Tm er påkrævet for at indstille PCR-udglødningstemperaturen.Ideelt set er annealingstemperaturen lav nok til at sikre effektiv annealing af primerne med målsekvensen, men høj nok til at reducere uspecifik binding.Rimelig udglødningstemperatur fra 55 ℃ til 70 ℃.Udglødningstemperatur er generelt indstillet til 5 ℃ lavere end Tm af primeren.
Der er flere formler for indstilling af Tm, som varierer meget afhængigt af den anvendte formel og sekvensen af primere.Fordi de fleste formler giver en estimeret Tm-værdi, er alle udglødningstemperaturer kun et udgangspunkt.Specificitet kan forbedres ved at analysere flere reaktioner, der gradvist hæver udglødningstemperaturen.Start under den estimerede Tm-5℃, og øg gradvist udglødningstemperaturen i et trin på 2℃.Højere annealingstemperatur vil reducere dannelsen af primerdimere og ikke-specifikke produkter.For de bedste resultater bør de to primere have omtrentlige Tm-værdier.Hvis Tm-forskellen for primerpar er mere end 5 ℃, vil primerne vise en signifikant fejlstart ved at bruge en lavere annealingstemperatur i cyklussen.Hvis de to primere Tm er forskellige, indstilles annealingstemperaturen til 5 ℃ lavere end den laveste Tm.Alternativt, for at øge specificiteten, kan fem cyklusser udføres først ved udglødningstemperaturer designet til højere Tm, efterfulgt af de resterende cyklusser ved udglødningstemperaturer designet til lavere Tm.Dette gør det muligt at få en delvis kopi af destinationsskabelonen under stramme forhold.
4. Primerens renhed og stabilitet
Standardrenheden af brugerdefinerede primere er tilstrækkelig til de fleste PCR-applikationer.Fjernelsen af benzoyl- og isobutylylgrupper ved afsaltning er minimal og interfererer derfor ikke med PCR.Nogle applikationer kræver oprensning for at fjerne eventuelle ikke-fuldlængde sekvenser i synteseprocessen.Disse trunkerede sekvenser opstår, fordi effektiviteten af DNA-syntesekemi ikke er 100 %.Dette er en cirkulær proces, der bruger gentagne kemiske reaktioner, da hver base tilføjes for at lave DNA fra 3′ til 5′.Du kan fejle i begge cyklusser.Længere primere, især dem, der er større end 50 baser, har en stor andel af trunkerede sekvenser og kan kræve oprensning.
Udbyttet af primere påvirkes af effektiviteten af syntetisk kemi og oprensningsmetode.Biofarmaceutiske virksomheder, såsom Cytology og Shengong, bruger alle en minimum OD-enhed for at sikre det samlede output af oligonukleosid.Brugerdefinerede primere sendes i tør pulverform.Det er bedst at genopløse primerne i TE, så den endelige koncentration er 100μM.TE er bedre end deioniseret vand, fordi vandets pH ofte er sur og vil forårsage hydrolyse af oligonukleosider.
Stabiliteten af primere afhænger af opbevaringsbetingelserne.Tørt pulver og opløste primere skal opbevares ved -20 ℃.Primere opløst i TE ved koncentrationer større end 10 μM kan opbevares stabilt ved -20 ℃ i 6 måneder, men kan kun opbevares ved stuetemperatur (15 ℃ til 30 ℃) i mindre end 1 uge.Tørpulverprimere kan opbevares ved -20 C i mindst 1 år og ved stuetemperatur (15 C til 30 C) i op til 2 måneder.
5. Enzymer og deres koncentrationer
På nuværende tidspunkt er den anvendte Taq DNA-polymerase dybest set det genteknologiske enzym syntetiseret af coliforme bakterier.Mængden af enzym, der er nødvendig for at katalysere en typisk PCR-reaktion, er ca. 2,5 U (refererer til det samlede reaktionsvolumen på 100 ul).Hvis koncentrationen er for høj, kan det føre til uspecifik amplifikation;hvis koncentrationen er for lav, vil mængden af syntetisk produkt blive reduceret.
6. Kvalitet og koncentration af dNTP
Kvaliteten af dNTP er tæt forbundet med koncentrationen og effektiviteten af PCR-amplifikation.dNTP-pulveret er granulært, og dets variabilitet mister sin biologiske aktivitet, hvis det opbevares forkert.dNTP-opløsningen er sur og bør bruges i høj koncentration med 1M NaOH eller 1M Tris.HCL-bufferopløsning for at justere dens PH til 7,0 ~ 7,5, lille mængde underemballage, frossen opbevaring ved -20 ℃.Multipel fryse-optøning vil nedbryde dNTP.Ved PCR-reaktion skal dNTP være 50 ~ 200umol/L.Især skal man være opmærksom på, at koncentrationen af de fire DNTPS skal være ens (lige muldvarp præparation).Hvis koncentrationen af en af dem er forskellig fra de andre (højere eller lavere), vil mismatch blive forårsaget.For lav koncentration vil reducere udbyttet af PCR-produkter.dNTP kan kombineres med Mg2+ og reducere koncentrationen af frit Mg2+.
7. Skabelon (målgen) nukleinsyre
Mængden og oprensningsgraden af template-nukleinsyre er et af nøgleleddet for succes eller fiasko for PCR.De traditionelle DNA-oprensningsmetoder bruger normalt SDS og protease K til at fordøje og bortskaffe prøver.SDS's hovedfunktioner er: opløse lipider og proteiner på cellemembranen, og dermed ødelægge cellemembranen ved at opløse membranproteiner, og dissociere nukleare proteiner i cellen, SDS kan også kombineres med proteiner og præcipitere;Protease K kan hydrolysere og fordøje proteiner, især histoner bundet med DNA, og derefter bruge organisk opløsningsmiddel phenol og chloroform til at ekstrahere proteiner og andre cellekomponenter og bruge ethanol eller isopropylalkohol til at udfælde nukleinsyre.Den ekstraherede nukleinsyre kan bruges som skabelon til PCR-reaktioner.Til generelle kliniske detektionsprøver kan en hurtig og enkel metode bruges til at opløse celler, lysere patogener, fordøje og fjerne proteiner fra kromosomer til frie målgener og direkte anvendes til PCR-amplifikation.RNA-skabelonekstraktion bruger sædvanligvis guanidinisothiocyanat- eller protease K-metoden for at forhindre RNase i at nedbryde RNA.
8.Mg2+ koncentration
Mg2+ har en signifikant effekt på specificiteten og udbyttet af PCR-amplifikation.I almindelighed PCR-reaktioner, når koncentrationen af forskellige dNTP er 200umol/L, er den passende koncentration af Mg2+ 1,5 ~ 2,0mmol/L.Mg2+ koncentrationen er for høj, reaktionsspecificiteten falder, ikke-specifik amplifikation forekommer, for lav koncentration vil reducere aktiviteten af Taq DNA polymerase, hvilket resulterer i reduktion af reaktionsprodukter.
Magnesiumioner påvirker flere aspekter af PCR, såsom DNA-polymeraseaktivitet, som påvirker udbyttet;Et andet eksempel er primer-annealing, som påvirker specificiteten.dNTP og skabelon binder til magnesiumion, hvilket reducerer mængden af fri magnesiumion, der kræves til enzymaktivitet.Den optimale magnesiumionkoncentration varierer for forskellige primerpar og skabeloner, men en typisk PCR-startkoncentration med 200 μM dNTP er 1,5 mM (bemærk: For real-time kvantitativ PCR skal du bruge 3 til 5 mM magnesiumionopløsning med en fluorescerende probe).Højere koncentrationer af frie magnesiumioner øger udbyttet, men øger også uspecifik amplifikation og mindsker pålideligheden.For at bestemme den optimale koncentration blev magnesiumiontitreringer udført i trin på 0,5 mM fra 1 mM til 3 mM.For at reducere afhængigheden af magnesiumion-optimering kan Platinum Taq DNA-polymerase anvendes.Platin Taq DNA-polymerase er i stand til at opretholde funktion over et bredere område af magnesiumionkoncentrationer end Taq DNA-polymerase og kræver derfor mindre optimering.
9. Pcr-fremmende tilsætningsstoffer
Optimering af annealingstemperatur, primerdesign og magnesiumionkoncentration er tilstrækkelig til meget specifik amplifikation af de fleste skabeloner;nogle skabeloner, herunder dem med højt GC-indhold, kræver dog yderligere foranstaltninger.Additiver, der påvirker DNA's smeltetemperatur, giver en anden måde at forbedre produktspecificitet og udbytte på.Fuld denaturering af skabelonen er påkrævet for de bedste resultater.
Derudover forhindrer den sekundære struktur primerbinding og enzymforlængelse.
PCR-additiver, herunder formamid, DMSO, glycerin, betain og PCRx Enhancer Solution, forbedrer amplifikation.Deres mulige mekanisme er at reducere smeltetemperaturen og dermed hjælpe annealingen af primere og hjælpe med at forlænge DNA-polymerase gennem den sekundære strukturregion.PCRx Solution har andre fordele.Minimal magnesiumionoptimering er påkrævet, når den bruges sammen med Platinum Taq DNA-polymerase og Platinum Pfx DNA-polymerase.Således kombineres Platinum-teknikken med additivet for at øge specificiteten og samtidig reducere afhængigheden af den tredje tilgang, magnesiumion-optimering.For de bedste resultater bør koncentrationen af additiver optimeres, især DMSO, formamid og glycerol, som hæmmer Taq DNA-polymerase.
10. Varm start
Hotstart PCR er en af de vigtigste metoder til at forbedre PCR-specificiteten ud over et godt primerdesign.Selvom den optimale forlængelsestemperatur for Taq DNA-polymerase er 72 ℃, forbliver polymerasen aktiv ved stuetemperatur.Således produceres ikke-specifikke produkter, når holdetemperaturen er lavere end annealingstemperaturen under forberedelsen af PCR-reaktionen og i begyndelsen af den termiske cyklus.Når først disse ikke-specifikke produkter er dannet, amplificeres de effektivt.Hot-start PCR er særligt effektiv, når de steder, der bruges til primerdesign, er begrænset af placeringen af genetiske elementer, såsom stedsrettede mutationer, ekspressionskloning eller konstruktion og manipulation af genetiske elementer, der bruges til DNA-manipulation.
En almindelig metode til at begrænse aktiviteten af Taq DNA-polymerase er at fremstille PCR-reaktionsopløsning på is og placere den i et forvarmet PCR-apparat.Denne metode er enkel og billig, men den fuldender ikke enzymets aktivitet og eliminerer derfor ikke fuldstændig amplifikationen af ikke-specifikke produkter.
Termisk priming forsinker DNA-syntesen ved at hæmme en væsentlig komponent, indtil PCR-apparatet når denatureringstemperaturen.De fleste manuelle termiske initieringsmetoder, herunder forsinket tilsætning af Taq DNA-polymerase, er besværlige, især til anvendelser med høj kapacitet.Andre termiske primingmetoder bruger et voksskjold til at omslutte en væsentlig komponent, herunder magnesiumioner eller enzymer, eller til fysisk at isolere reaktive komponenter, såsom skabeloner og buffere.Under den termiske cyklus frigives de forskellige komponenter og blandes sammen, efterhånden som voksen smelter.Ligesom den manuelle varmstartmetode er voksafskærmningsmetoden besværlig og tilbøjelig til forurening og er ikke egnet til applikationer med høj gennemstrømning.
Platin DNA polymerase er praktisk og effektiv til automatisk varmstart PCR.Platin Taq DNA polymerase består af rekombinant Taq DNA polymerase kombineret med monoklonalt antistof mod Taq DNA polymerase.Antistofferne er formuleret ved PCR for at hæmme enzymaktivitet under langvarig temperaturhold.Taq DNA-polymerase blev frigivet til reaktionen under 94℃-isoleringen af denatureringstrinnet, hvilket genoprettede fuld polymeraseaktivitet.I modsætning til kemisk modificeret Taq DNA-polymerase til termisk initiering, kræver platinenzym ikke langvarig isolering ved 94 ℃ (10 til 15 minutter) for at aktivere polymerasen.Med PlatinumTaq DNA-polymerase blev 90 % af Taq DNA-polymeraseaktivitet genoprettet efter 2 minutter ved 94 ℃.
11. Nest-PCR
Successive runder af amplifikation ved brug af indlejrede primere kan forbedre specificitet og sensitivitet.Den første runde er en standardforstærkning på 15 til 20 cyklusser.En lille fraktion af det indledende amplifikationsprodukt blev fortyndet 100 til 1000 gange og tilsat til den anden runde amplifikation i 15 til 20 cyklusser.Alternativt kan det initiale amplificerede produkt dimensioneres ved gelrensning.En nestet primer anvendes i anden amplifikationsrunde, som kan binde til målsekvensen inde i den første primer.Anvendelsen af indlejret PCR reducerer muligheden for amplifikation af flere målsteder, fordi der er få målsekvenser, der er komplementære til begge sæt af primere.Det samme totale antal cyklusser (30 til 40) med de samme primere amplificerede de ikke-specifikke steder.Nested PCR øger følsomheden af begrænsede målsekvenser (f.eks. sjældne mrnas) og forbedrer specificiteten af vanskelige PCRS (f.eks. 5' RACE).
12. Faldende PCR
Faldende PCR forbedrer specificiteten ved at bruge stramme annealingsbetingelser for de første par PCR-cyklusser.Cyklussen starter ved en udglødningstemperatur, der er cirka 5 ℃ højere end den estimerede Tm, derefter reduceres hver cyklus med 1 ℃ til 2 ℃, indtil annealingstemperaturen er under Tm 5 ℃.Kun destinationsskabelonen med den højeste homologi vil blive amplificeret.Disse produkter fortsætter med at ekspandere i efterfølgende cyklusser og fortrænger de forstærkede uspecifikke produkter.Descending PCR er nyttig til metoder, hvor graden af homologi mellem primer og målskabelon ikke er kendt, såsom AFLP DNA-fingeraftryk.
Relaterede PCR-sæt
2× PCR HeroTMMix-systemet har højere tolerance over for PCR-hæmmere end det almindelige PCR Mix-system og kan nemt klare PCR-amplifikation af forskellige komplekse templates.Det unikke reaktionssystem og højeffektive Taq Hero gør, at PCR-reaktionen har højere amplifikationseffektivitet, specificitet og sensitivitet.
Højere forstærkningseffektivitet
Det har 5'→3' DNA-polymeraseaktivitet og 5'→3' exonukleaseaktivitet uden 3'→5' exonukleaseaktivitet.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Specifik-optimeret buffer og hot-start Taq enzym kan forhindre uspecifik amplifikation og primer dimer dannelse
Høj følsomhed – kan registrere lave kopier af skabelonen
Sættet bruger et unikt Foregene revers transkriptionsreagens og Foregene HotStar Taq DNA Polymerase kombineret med et unikt reaktionssystem for effektivt at forbedre amplifikationseffektiviteten og specificiteten af reaktionen.
Indlægstid: maj-09-2023
