RT-qPCR er udviklet ud fra almindelig PCR-teknologi.Det tilføjer fluorescerende kemikalier (fluorescerende farvestoffer eller fluorescerende prober) til det traditionelle PCR-reaktionssystem og detekterer PCR-annealing og forlængelsesprocessen i realtid i henhold til deres forskellige luminescerende mekanismer.Fluorescerende signalændringer i mediet bruges til at beregne mængden af ​​produktændring i hver PCR-cyklus.I øjeblikket er de mest almindelige metoder fluorescerende farvestofmetode og probemetode.

Fluorescerende farvestofmetode:
Nogle fluorescerende farvestoffer, såsom SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO osv., udsender ikke lys af sig selv, men udsender fluorescens efter binding til den mindre rille af dsDNA.Derfor kan maskinen i begyndelsen af ​​PCR-reaktionen ikke detektere det fluorescerende signal.Når reaktionen fortsætter til annealing-forlængelsen (to-trins-metoden) eller forlængelsesstadiet (tre-trins-metoden), åbnes dobbeltstrengene på dette tidspunkt, og den nye DNA-polymerase Under strengsyntese kombineres fluorescerende molekyler i dsDNA-minor-rillen og udsender fluorescens.Efterhånden som antallet af PCR-cyklusser stiger, kombineres flere og flere farvestoffer med dsDNA, og det fluorescerende signal forbedres også kontinuerligt.Tag SYBR Green Ⅰ som et eksempel.
Probe metode:
Taqman probe er den mest almindeligt anvendte hydrolysesonde.Der er en fluorescerende gruppe i 5′-enden af ​​proben, normalt FAM.Proben i sig selv er en sekvens komplementær til målgenet.Der er en fluorescerende quenching-gruppe i 3′-enden af ​​fluoroforen.I henhold til princippet om fluorescensresonansenergioverførsel (Förster resonance energy transfer, FRET), når reporterfluorescensgruppen (donorfluorescerende molekyle) og den slukkende fluorescerende gruppe (acceptor fluorescerende molekyle) Når excitationsspektret overlapper og afstanden er meget tæt på (7-10 fluorescerende molekyle af donoren), acceptormolekylet, mens autofluorescensen er svækket.Derfor, i begyndelsen af ​​PCR-reaktionen, når proben er fri og intakt i systemet, vil reporter-fluorescensgruppen ikke udsende fluorescens.Ved annealing binder primeren og proben til skabelonen.Under forlængelsesstadiet syntetiserer polymerasen løbende nye kæder.DNA-polymerase har 5′-3′ exonukleaseaktivitet.Når den når proben, vil DNA-polymerasen hydrolysere proben fra skabelonen, adskille reporter-fluorescerende gruppe fra quencher-fluorescerende gruppe og frigive det fluorescerende signal.Da der er et en-til-en forhold mellem proben og skabelonen, er probemetoden overlegen i forhold til farvestofmetoden med hensyn til testens nøjagtighed og følsomhed.

Fig. 1 Princippet for qRT-PCR

Primer design
Principper:

Primerne bør designes i den konserverede region af nukleinsyreserien og have specificitet.

Det er bedst at bruge cDNA-sekvens, og mRNA-sekvens er også acceptabel.Hvis ikke, så find ud af cd-regionens design af DNA-sekvensen.
Længden af ​​det fluorescerende kvantitative produkt er 80-150 bp, den længste er 300 bp, primerlængden er generelt mellem 17-25 baser, og forskellen mellem opstrøms- og nedstrømsprimerne bør ikke være for stor.

G+C-indholdet er mellem 40% og 60%, og 45-55% er bedst.
TM-værdien er mellem 58-62 grader.
Forsøg at undgå primer-dimere og selv-dimere, (vises ikke mere end 4 par på hinanden følgende komplementære baser) hårnålestruktur, hvis det er uundgåeligt, gør ΔG<4,5kJ/mol* Hvis du ikke kan sikre, at gDNA er blevet fjernet under omvendt transkription. /C, A/G kontinuert struktur (2-3) primere og ikke-
specifik Homologien af ​​den heterogent amplificerede sekvens er fortrinsvis mindre end 70 % eller har 8 komplementær basehomologi.
Database:
CottonFGD søgning efter nøgleord
Primer design:
IDT-qPCR primer design

Fig2 IDT online primer design værktøj side

Fig3 resultatside visning
Design af lncRNA primere:
lncRNA:de samme trin som mRNA.
miRNA:Princippet for stam-loop-metoden: Da alle miRNA'er er korte sekvenser på omkring 23 nt, kan direkte PCR-detektion ikke udføres, så stem-loop-sekvensværktøjet bruges.Stammeløkkesekvensen er et enkeltstrenget DNA på omkring 50 nt, som kan danne en hårnålestruktur af sig selv.3 'Enden kan designes som en sekvens komplementær til miRNA-delfragmentet, derefter kan target-miRNA'et forbindes til stam-loop-sekvensen under revers transkription, og den totale længde kan nå 70bp, hvilket er på linje med længden af ​​det amplificerede produkt bestemt ved qPCR.Tailing miRNA primer design.
Amplifikationsspecifik detektion:
Online blast database: CottonFGD blast efter sekvens lighed
Lokal blast: Se at bruge Blast+ til at lave lokal blast, linux og Macos kan direkte etablere en lokal database, win10 system kan også udføres efter installation af ubuntu bash.Opret lokal blast-database og lokal blast;åben ubuntu bash på win10.
Bemærk: Højlandsbomuld og havø-bomuld er tetraploide afgrøder, så resultatet af sprængningen vil ofte være to eller flere kampe.I fortiden vil brug af NAU-cd'er som en database til at udføre blast sandsynligvis finde to homologe gener med kun få SNP-forskelle.Normalt kan de to homologe gener ikke adskilles ved primerdesign, så de behandles som ens.Hvis der er en tydelig indel, er primeren normalt designet på indel, men dette kan føre til den sekundære struktur af primeren. Den frie energi bliver højere, hvilket fører til et fald i amplifikationseffektiviteten, men dette er uundgåeligt.

Påvisning af primer sekundær struktur:
Trin:åben oligo 7 → indtast skabelonsekvens → luk undervindue → gem → lokaliser primer på skabelon, tryk på ctrl+D for at indstille primerlængde → analyser forskellige sekundære strukturer, såsom selvdimeriseringslegeme, heterodimer, hårnål, mismatch osv. De sidste to billeder i figur 4 er testresultaterne af primerne.Resultatet af frontprimeren er godt, der er ingen tydelig dimer- og hårnålestruktur, ingen kontinuerlige komplementære baser, og den absolutte værdi af fri energi er mindre end 4,5, mens bagprimeren viser kontinuerlig De 6 baser er komplementære, og den frie energi er 8,8;desuden vises en mere alvorlig dimer i 3'-enden, og en dimer med 4 på hinanden følgende baser vises.Selvom den frie energi ikke er høj, kan 3′ dimer Chl alvorligt påvirke amplifikationsspecificitet og amplifikationseffektivitet.Derudover er det nødvendigt at tjekke for hårnåle, heterodimerer og uoverensstemmelser.

Fig3 oligo7 detektionsresultater
Detektion af amplifikationseffektivitet:
Amplifikationseffektiviteten af ​​PCR-reaktionen påvirker PCR-resultaterne alvorligt.Også i qRT-PCR er amplifikationseffektiviteten særlig vigtig for de kvantitative resultater.Fjern andre stoffer, maskiner og protokoller i reaktionsbufferen.Kvaliteten af ​​primerne har også stor indflydelse på amplifikationseffektiviteten af ​​qRT-PCR.For at sikre nøjagtigheden af ​​resultaterne skal både den relative fluorescens-kvantificering og den absolutte fluorescens-kvantificering for at detektere amplifikationseffektiviteten af ​​primerne.Det erkendes, at den effektive qRT-PCR-amplifikationseffektivitet er mellem 85 % og 115 %.Der er to metoder:
1. Standardkurvemetode:
en.Bland cDNA
b.Gradientfortynding
c.qPCR
d.Lineær regressionsligning til beregning af amplifikationseffektiviteten
2. LinRegPCR
LinRegPCR er et program til analyse af real-time RT-PCR Data, også kaldet kvantitative PCR (qPCR) data baseret på SYBR Green eller lignende kemi.Programmet bruger ikke-baseline-korrigerede data, udfører en baseline-korrektion på hver prøve separat, bestemmer et window-of-linearity og bruger derefter lineær regressionsanalyse til at passe en lige linje gennem PCR-datasættet.Ud fra hældningen af ​​denne linje beregnes PCR-effektiviteten for hver enkelt prøve.Den gennemsnitlige PCR-effektivitet pr. amplikon og Ct-værdien pr. prøve bruges til at beregne en startkoncentration pr. prøve, udtrykt i vilkårlige fluorescensenheder.Datainput og -output foregår via et Excel-regneark.Kun prøve
blanding er påkrævet, ingen gradient
trin er påkrævet:(Tag Bole CFX96 som et eksempel, ikke helt Maskine med tydelig ABI)
eksperiment:det er et standard qPCR-eksperiment.
qPCR data output:LinRegPCR kan genkende to former for outputfiler: RDML eller kvantificering Amplifikationsresultat.Faktisk er det realtidsdetektionsværdien af ​​cyklusnummeret og fluorescenssignalet af maskinen, og amplifikationen opnås ved at analysere fluorescensændringsværdien af ​​den lineære segmenteffektivitet.
Datavalg: I teorien burde RDML-værdien være brugbar.Det anslås, at problemet med min computer er, at softwaren ikke kan genkende RDML, så jeg har excel-outputværdien som de originale data.Det anbefales at udføre en grov screening af dataene først, såsom manglende tilføjelse af prøver osv. Punkterne kan slettes i outputdataene (selvfølgelig kan du ikke slette dem, LinRegPCR vil ignorere disse punkter på et senere tidspunkt).

Fig5 qPCR dataeksport

Fig6 udvælgelse af kandidatprøver

Datainput:Åbn kvalifikationsforstærkningsresultater.xls, → åbn LinRegPCR → fil → læs fra excel → vælg parametre som vist i figur 7 → OK → klik på bestemme basislinjer

Fig. 7 trin i linRegPCR-datainput

Resultat:Hvis der ikke er nogen gentagelse, kræves ingen gruppering.Hvis der er gentagelse, kan grupperingen redigeres i prøvegrupperingen, og navnet på genet indtastes i identifikatoren, og så vil det samme gen automatisk blive grupperet.Til sidst skal du klikke på filen, eksportere excel og se resultaterne.Amplifikationseffektiviteten og R2-resultaterne for hver brønd vil blive vist.For det andet, hvis du opdeler i grupper, vil den korrigerede gennemsnitlige forstærkningseffektivitet blive vist.Sørg for, at amplifikationseffektiviteten af ​​hver primer er mellem 85 % og 115 %.Hvis den er for stor eller for lille, betyder det, at amplifikationseffektiviteten af ​​primeren er dårlig.

Fig. 8 Resultat og dataoutput

Eksperimentel proces:
RNA kvalitetskrav:
Renhed:1.72,0 indikerer, at der kan være resterende isothiocyanat.Ren nukleinsyre A260/A230 bør være omkring 2. Hvis der er en kraftig absorption ved 230 nm, indikerer det, at der er organiske forbindelser såsom phenationer.Derudover kan det påvises ved 1,5% agarosegelelektroforese.Peg på markøren, fordi ssRNA'et ikke har nogen denaturering, og molekylvægtlogaritmen ikke har en lineær sammenhæng, og molekylvægten kan ikke udtrykkes korrekt.Koncentration: Teoretiskikkemindre end 100 ng/ul, hvis koncentrationen er for lav, er renheden generelt lav ikke høj

Fig9 RNA gel

Hvis prøven er dyrebar, og RNA-koncentrationen er høj, anbefales det desuden at alikvotere den efter ekstraktion og fortynde RNA'et til en slutkoncentration på 100-300 ng/ul til revers transkription.Iprocessen med omvendt transskription, når mRNA transskriberes, bruges oligo (dt) primere, der specifikt kan binde til polyA-haler, til revers transkription, mens lncRNA og circRNA anvender tilfældige hexamer (Random 6 mer) primere til revers transkription af total RNA. Til miRNA anvendes miRNA-specifikke neck-loop reverse transkripter.Mange virksomheder har nu lanceret specielle tailing-sæt.For stem-loop-metoden er tailing-metoden mere bekvem, høj gennemstrømning og reagensbesparende, men effekten af ​​at skelne miRNA'er af samme familie burde ikke være så god som stam-loop-metoden.Hvert revers transkriptionskit har krav til koncentrationen af ​​genspecifikke primere (stam-loops).Den interne reference, der bruges til miRNA, er U6.I processen med stilk-løkke-inversion skal et rør med U6 vendes separat, og de forreste og bageste primere af U6 skal tilføjes direkte.Både circRNA og lncRNA kan bruge HKG'er som intern reference.IcDNA påvisning,
hvis der ikke er noget problem med RNA, burde cDNA også være fint.Men hvis perfektion af eksperimentet forfølges, er det bedst at bruge et internt referencegen (Reference gen, RG), der kan skelne gDNA fra cd'er.Generelt er RG et husholdningsgen.HKG) som vist i figur 10;På det tidspunkt lavede jeg sojabønnelagringsprotein og brugte actin7-holdige introner som en intern reference.Størrelsen af ​​det amplificerede fragment af denne primer i gDNA var 452 bp, og hvis cDNA blev anvendt som skabelon, var det 142 bp.Derefter viste testresultaterne, at en del af cDNA'et faktisk var kontamineret med gDNA, og det viste også, at der ikke var noget problem med resultatet af revers transkription, og det kunne bruges som skabelon til PCR.Det nytter ikke at køre agarosegelelektroforese direkte med cDNA, og det er et diffust bånd, hvilket ikke er overbevisende.

Fig. 10 cDNA-detektion

Bestemmelse af qPCR-betingelserer generelt ikke noget problem ifølge protokollen for sættet, hovedsageligt i trinnet med tm-værdi.Hvis nogle primere ikke er godt designet under primerdesign, hvilket resulterer i en stor forskel mellem tm-værdien og den teoretiske 60°C, anbefales det, at cDNA'et Efter at prøverne er blandet, kører en gradient-PCR med primere, og forsøg at undgå at indstille temperaturen uden bånd som TM-værdien.

Dataanalyse

Den konventionelle relative fluorescens kvantitative PCR-behandlingsmetode er grundlæggende i henhold til 2.-ΔΔCT.Databehandling skabelon.

Relaterede produkter:

Real Time PCR Nem^TM -Taqman

Real Time PCR Nem^TM –SYBR GRØN I

RT Easy I (Master Premix til første streng cDNA syntese)

RT Easy II (Master Premix til første streng cDNA syntese til qPCR)