Detektions specificitet
I de fleste tilfælde er formålet med primerdesign at maksimere specificiteten af PCR.Dette bestemmes af den mere eller mindre forudsigelige indflydelse fra mange variabler.En vigtig variabel er sekvensen i 3'-enden af primeren.
Det er vigtigt, at PCR-assays designet til specificitet er mere tilbøjelige til at opretholde høj effektivitet over et bredt dynamisk område, fordi assayet ikke producerer ikke-specifikke amplifikationsprodukter og derved konkurrerer med PCR-reagenser eller hæmmer hovedamplifikationsreaktionen.
Naturligvis er specificitet i nogle tilfælde ikke det vigtigste, for eksempel når målet er at kvantificere nært beslægtede, men forskellige patogener, der kræves specielle design-, optimerings- og verifikationsstandarder.
Smeltekurven er en standardmetode til at vurdere specificiteten af amplikoner, i det mindste med hensyn til, om et enkelt mål skal amplificeres.Det skal dog understreges, at smeltekurverne kan være misvisende, fordi de for eksempel kan blive påvirket af de kombinerede effekter af suboptimale primere og lave skabelonkoncentrationer.
P5 |Smeltekurven viser Tm-skiftene opnået fra to påvisninger af forskellige mængder af to mål-DNA'er.
A. Ved højere koncentrationer (ad) er der ingen tydelig primerdimer efter qPCR-målingen er afsluttet.Når skabelonkoncentrationen falder til 50 kopier (e), begynder et uspecifikt produkt at dukke op og bliver det eneste produkt med den laveste koncentration (f).
B. Testen registrerede den samme Tms ved alle målkoncentrationer, og der var ingen tydelig primerdimer selv ved den laveste koncentration (5 kopier).Ved anvendelse af disse to detektionsmetoder blev der ikke påvist amplifikationsprodukter i NTC'er.
P5 viser opløsningskurverne opnået med prøver, hvor skabelonen er til stede i forskellige koncentrationer.P 5a viser, at ved de to laveste koncentrationer er Tms for de producerede ikke-specifikke amplifikationsprodukter lavere end for de specifikke amplikoner.
Det er klart, at denne detektionsmetode ikke kan bruges pålideligt til at detektere mål, der findes i lave koncentrationer.
Interessant nok registrerede NTC'er, dvs. prøver uden DNA overhovedet, ikke (ikke-specifikke) amplifikationsprodukter, hvilket indikerer, at genomisk baggrunds-DNA kan deltage i ikke-specifik amplifikation/polymerisering.
Nogle gange kan sådanne baggrundsprimere og ikke-specifik amplifikation ikke afhjælpes, men det er ofte muligt at designe en detektionsmetode, der ikke har uspecifik amplifikation i nogen template-koncentration og NTC (P 5b).
Her vil selv registrering af amplifikationen af målkoncentrationen med en Cq på 35 producere en specifik opløsningskurve.På samme måde viste NTC'er ingen tegn på ikke-specifik amplifikation.Nogle gange kan detektionsadfærden være afhængig af moderluden, og kun ikke-specifik amplifikation påvises i visse buffersammensætninger, som kan være relateret til forskellige Mg2+-koncentrationer.
Stabilitet af detektion
Optimeringen af Ta er et nyttigt trin i den empiriske verifikations- og optimeringsproces for qPCR-detektion.Det giver en direkte indikation af robustheden af primersættet ved at vise den temperatur (eller temperaturområde), der producerer den laveste Cq uden at forstærke NTC.
Forskellen i følsomhed på to til fire gange er muligvis ikke vigtig for personer med høj mRNA-ekspression, men for diagnostiske tests kan det betyde forskellen mellem positive og falske negative resultater.
Ta-egenskaberne af qPCR-primere kan variere meget.Nogle test er ikke særlig robuste, og hvis de ikke udføres under den optimale Ta-værdi af primerne, vil de hurtigt kollapse.
Dette er vigtigt, fordi denne type påvisning ofte er problematisk i den virkelige verden, og prøvens renhed, koncentrationen af DNA eller tilstedeværelsen af andet DNA er muligvis ikke optimal.
Derudover kan målkopiantallet variere inden for et bredt område, og reagenserne, plastikredskaberne eller instrumenterne kan være forskellige fra dem, der blev brugt ved opsætning af testen.
P6|Temperaturgradienten viser den forskellige robusthed af PCR-detektion.
A. Brug Biolines Sensifast SYBR mastermix (katalognummer BIO-98050) til at udføre PCR på cDNA fremstillet ud fra human hjerne-RNA.
B. Brug Bio-Rads CFX qPCR-instrument til at registrere amplifikationskortet og opløsningskurven for apalen (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Amplifikationsgraf og smeltekurve for ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Amplifikationsgraf og opløsningskurve for GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs registreret ved forskellige udglødningstemperaturer, der viser forskellen i Cq registreret under en 7C temperaturgradient.
P 6 viser et typisk resultat af en uønsket test, hvor qPCR blev udført under anvendelse af en gradient Tas mellem 59C og 67C (P 6a), under anvendelse af primere for tre humane hjernespecifikke gener.
Det kan ses fra amplifikationsgrafen, at Opalin-primere er langt fra ideelle, fordi deres optimale Ta-område er meget snævert (figur 6b), det vil sige, at Cqs er vidt spredt, hvilket resulterer i, at Cqs er signifikant sammenlignet med deres optimale Cqs Low.
Denne detektionsmetode er ustabil og kan føre til suboptimal amplifikation.Derfor bør dette par primere redesignes.Derudover viser smeltekurveanalysen (indsat), at specificiteten af denne detektionsmetode også kan være problematisk, fordi smeltekurven for hver Ta er forskellig.
ACSBG1-detektionsmetoden vist i P 6c er mere robust end Opalin-detektionsmetoden ovenfor, men den er stadig langt fra ideel, og det er sandsynligt, at den kan forbedres.
Vi understreger dog, at der ikke er nogen nødvendig sammenhæng mellem robusthed og specificitet, fordi opløsningskurven produceret ved denne detektionsmetode viser den samme topværdi i alle Tas (indsat).
På den anden side er robusthedstesten meget mere tolerant, idet den producerer lignende Cq'er i en bred vifte af Tas, som i GFAP-testen vist i P 6d.
Forskellen i Cqs opnået i det samme 8 grader Celsius område er mindre end 1, og opløsningskurven (indsat) bekræfter detekteringsegenskaberne i dette temperaturområde.Det er værd at bemærke, at det beregnede Tas og det faktiske Ta-område kan være meget forskellige.
Der er mange retningslinjer designet til at hjælpe forskere med at designe effektive primere, hvoraf de fleste er baseret på længe etablerede regler, og der har været meget opmærksomhed på 3′enden af primerne.Det anbefales ofte at inkludere en G eller C i 3'-enden og to G- eller C-baser (GC-klemme), men ikke mere end to af de sidste 5 baser.
I praksis kan disse regler vejlede forskerne, men de er ikke nødvendigvis korrekte under alle omstændigheder.
P7 |3'-enden af primeren har ringe effekt på specificitet eller effektivitet.
A. Positionen af primerne for det humane HIF-1α (NM_181054.2) gen.
B. Brug Agilent Brilliant III SYBR Grøn moderlud (kat. nr. 600882) til at forstærke seks testemner.
C. Amplifikationsgraf og smeltekurve optaget af Bio-Rads CFX qPCR instrument og 3'-ende primere.NTC'er er vist med rødt.
D. Cqs registrering af hvert testelement
For eksempel er resultatet i P 7 i modstrid med 3'ende reglen.Alle designs producerer stort set de samme resultater, med kun to primerkombinationer, der fører til ikke-specifik amplifikation i NTC.
Vi kan dog ikke understøtte effekten af GC-klippet, for i dette tilfælde reducerer brug af A eller T som maksimalt 30 baser ikke specificiteten.
Test C, hvor F-primeren ender i GGCC, registrerede Cq'er i NTC'er, hvilket indikerer, at man måske ønsker at undgå disse sekvenser i 30-enden.Vi understreger, at den eneste måde at bestemme den bedste 3'ende-sekvens af et primerpar på er at evaluere nogle kandidatprimere eksperimentelt.
Forstærkningseffektivitet
Det er vigtigt, at selvom ikke-specifik PCR-detektion aldrig kan blive specifik, kan amplifikationseffektiviteten justeres og maksimeres på mange forskellige måder ved at ændre enzymet, moderluden, tilsætningsstofferne og cyklusforholdene.
For at evaluere effektiviteten af PCR-detektion er det bedst at bruge en seriel fortynding på 10 eller 5 gange målnukleinsyren, det vil sige "standardkurvemetoden".
Hvis PCR-amplikoner eller syntetiske DNA-mål anvendes til at generere en standardkurve, skal seriefortyndinger af disse mål blandes med en konstant mængde baggrunds-DNA (såsom genomisk DNA).
P8 |Fortyndingskurve for at evaluere effektiviteten af PCR.
A. Brug primere til HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA og R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC og Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalognummer 600882) til PCR og smeltekurveforhold.
B. 100 ng RNA blev omvendt transskriberet, fortyndet 2 gange, og serielt fortyndede cDNA-prøver blev fortyndet 5 gange til 1 ng humant genomisk DNA.Smeltekurven er vist i indsættelsen.
C. RT-reaktionen, fortyndingen og seriefortyndingen blev gentaget for den anden cDNA-prøve, og resultaterne var ens.
P 8 viser to standardkurver, der anvender den samme detektionsmetode på to forskellige cDNA-prøver, resultatet er den samme effektivitet, omkring 100 %, og R2-værdien er også ens, det vil sige graden af tilpasning mellem de eksperimentelle data og regressionslinjen eller dataene Graden af linearitet.
De to standardkurver er sammenlignelige, men ikke helt ens.Hvis formålet er nøjagtigt at kvantificere målet, skal det bemærkes, at det er uacceptabelt at give en kopitalsberegning uden at forklare usikkerheden
P9 |Måleusikkerhed forbundet med kvantificering ved hjælp af en standardkurve.
A. Brug primere til GAPDH (NM_002046) til at udføre PCR og smeltekurvebetingelser.F: ACAGTTGCCATGTAGACC og R: TAACTGGTTGAGCACAGG og Biolines Sensifast SYBR mastermix (katalognummer BIO-98050).
B. Amplifikationsdiagram, smeltekurve og standardkurve optaget med Bio-Rads CFX qPCR instrument.
C. Standardkurvegraf og 95 % konfidensinterval (CI).
D. Kopitallet og 95 % konfidensinterval for de tre Cq-værdier afledt af fortyndingskurven.
P 9 viser, at for en optimeret test er den iboende variabilitet af en enkelt standardkurve ca. 2 gange (95 % konfidensinterval, minimum til maksimum), hvilket kan være den mindste variabilitet, der kan forventes.
Relateret produkt:
Indlægstid: 30. september 2021
