Alle taler om princippet om qRT-PCR-eksperiment, primerdesign, resultatfortolkning osv., men jeg synes, jeg skal dele den eksperimentelle drift af qRT-PCR med dig.Det er lille, men det handler om resultater.

Før vi laver qRT-PCR, skal vi have en klar forståelse af vores eget RNA og operationsmetoder.Vores indsats er trods alt rettet mod at få resultater frem for blot at øve.Så før vi laver qRT-PCR, skal vi bestemme følgende problemer (hvoraf nogle kun gælder for SYBR).

1 Er du sikker på, at dit RNA ikke er nedbrudt?

NanoDrop 2000 kan kun detektere koncentrationen og renheden af ​​RNA, men kan ikke detektere integriteten af ​​RNA.

RNA-værdien (RNA-intesitetsnummer) kan afspejle integriteten af ​​RNA'et, som detekteres af Agilent 2100 Bioanalyzer-systemet.

Fig. Skematisk diagram af RIN-værdier for forskellige RNA-prøver (eukaryoter)

Laboratorier har dog generelt ikke Agilent 2100 Bioanalyzer.I dette tilfælde kan vi detektere gennem formaldehydgel, men kravet til den samlede mængde RNA er højt, så den hurtigste metode er at bruge almindelig gelelektroforese.Det er påkrævet at være i et nukleasefrit miljø, så det er nødvendigt at skylle elektroforesetanken, solflasken, gelbeslaget og kammen med DEPC-vand.Agarosen er også nukleasefri (så længe den er nyåbnet), og Loading Bufferen skal være friskåbnet så meget som muligt med 1,2 % gel.

Bemærk, at gelen skal være fuldstændig opløst, ellers vil den forårsage inhomogene bånd, som vist i prøve 9 i figuren.Hvis spændingen er for høj eller kører for længe, ​​vil det generere varme og forårsage RNA-nedbrydning, så spændingen og tiden bør kontrolleres rimeligt.Derudover kan gelløb også afgøre, om der er DNA-rester i prøven, og observere, om der er et stort antal tilbageholdte bånd i dispenseringsbrønden.

Figur.Gelelektroforesedetektion af RNA

2 Er du sikker på koncentrationen af ​​dit cDNA?

Erfaringen fra storebrødrene i laboratoriet er, at cDNA'et af 20 ul-systemet opnået ved hver inversion fortyndes direkte 20X, mens post-doc-søstrene fortyndes 10X.Jeg er normalt afhængig af situationen.Fordi kvaliteten af ​​RNA'et nævnt af hver person er forskellig, er niveauet af reversering også forskelligt, og reverseringsteknologien er muligvis ikke stabil.

Så hver gang jeg får det omvendte cDNA, vil jeg først fortynde det ca. 3 gange, og derefter bruge housekeeping-genet til at lave RT-PCR, antallet af cyklusser er generelt 25 cyklusser, for at identificere den specifikke koncentration og derefter bestemme den endelige fortyndingsfaktor.

3 Er du sikker på, at dine primere er nemme at bruge?

Det kan passere smeltekurven for qRT-PCR, men det koster stadig penge.For laboratorier uden mange penge, når de får mange primere, kan de bruge almindelig RT-PCR til at se om det er et enkelt bånd og identificere specificiteten af ​​primerne.Hvis laboratoriet ikke mangler penge, kan specificiteten af ​​alle primere identificeres én gang gennem smeltekurven.

4 Er du sikker på, at dine eksperimentelle forhold er egnede?

SYBR skal beskyttes mod stærkt lys, så prøv at slukke for lyset over hovedet, når du tilføjer SYBR-reagens, og behøver kun at bruge svagt lys for at fuldføre det.

Opbevar SYBR ved 4°C.Når den er i brug, vend forsigtigt op og ned for at blande godt for at undgå skum, og lad være med at vortex kraftigt.

Nogle yngre søstre kan godt lide at tegne mærker på PCR-tavlen af ​​frygt for at blande prøverne, hvilket er forkert.Fordi dine markører med stor sandsynlighed påvirker samlingen af ​​fluorescerende signaler, anbefaler jeg generelt juniorer at bruge eksperimentelle notesbøger til at hjælpe med hukommelsen, som vist nedenfor.

Figur.qRT-PCR prøveindlæsningsdiagram

5 Er du sikker på, at du gør det rigtigt?

Sørg for at bruge handsker, brug handsker, brug handsker og sig vigtige ting tre gange.

For at reducere eksponeringen af ​​SYBR for lys, vil jeg personligt gerne tilføje en skabelon først, som vist i figuren nedenfor.Ifølge erfaring vil tilføjelsen af ​​en lille mængde skabelon sandsynligvis forårsage stikprøvefejl.Derfor, for at minimere fejlen forårsaget af at tilføje en lille mængde skabelon, fordobler jeg normalt prøven igen og fordobler mængden, når jeg tilføjer prøven for at reducere mængden af ​​tilsat H2O2.

Figur.Skematisk diagram af qRT-PCR-belastning

Konfigurer derefter qRT-PCR-systemet som følger.

Figur.qRT-PCR system forberedelsesdiagram

BEMÆRK: Konfigurationsprocessen skal udføres på is.

Efter tilsætning af prøven, indsæt den gennemsigtige forseglingsfilm.Prøv ikke at røre ved overfladen af ​​den gennemsigtige forseglingsfilm med dine hænder, bare betjen fra rummet på begge sider af filmen.Fordi fingeraftryk også kan påvirke indsamlingen af ​​fluorescerende signaler.Brug derefter en centrifuge til hurtigt at centrifugere i 10 s ved lav hastighed for at forhindre prøven i at hænge på væggen.

Relaterede produkter:

Cell Direct RT-qPCR kit

RT Easy II