RT-qPCR er molekylærbiologiens grundlæggende eksperiment, og alle skal være bekendt med det.Det omfatter hovedsageligt tre trin: RNA-ekstraktion, revers transkription til cDNA og real-time fluorescerende kvantitativ PCR.Det hjælper ikke, hvad sker der?Det er sandsynligt, at der er et problem meddet omvendte transkriptionseksperiment!Selvom det ser ud til, at revers transkriptionseksperimentet kun behøver at tilføje RNA, dNTP, primere ogrevers transkriptasetil centrifugerøret og bland godt, men i selve driftsprocessen er der stadig mange detaljer, der skal lægges vægt på.Lad os lære om det!

Hvordan bedømmer man kvaliteten af ​​RNA?
For at opnå cDNA er kvaliteten af ​​RNA kritisk!RNA-kvalitet kan hovedsageligt påvises fra to aspekter:
(1) RNA-integritet:RNA-integritet kan verificeres ved agarosegelelektroforese. Tager man eukaryoter som et eksempel, har det komplette totale RNA tre klare bånd, molekylvægtene fra stor til lille er 28S, 18S og 5S, og 28S er dobbelt så lys som 18S;hvis tre bånd kan ses, men båndtypen er sløret eller Diffusion betyder, at RNA'et er delvist nedbrudt.På dette tidspunkt bedes du udføre den omvendte transkriptionsreaktion med det samme og øge skabeloninputtet passende;hvis kun et bånd med en lille molekylvægt eller intet bånd kan ses, er RNA'et fuldstændigt nedbrudt og skal ekstraheres igen.Agilent 2100 angiver integriteten af ​​RNA med topdiagram og RIN-værdi.Hvis nukleinsyren er intakt, er basislinjen af ​​elektroferogrammet flad;hvis nukleinsyren er alvorligt nedbrudt, er basislinjen ujævn, og flere nedbrydningstoppe vises;værdien af ​​RIN afspejler integriteten af ​​RNA'et, inden for området 0-10, jo større værdien er, jo bedre er kvaliteten af ​​RNA'et.Nå, jo højere grad af fuldstændighed.
(2) Renhed af RNA:Forholdet mellem OD260/280 kan detekteres ved UV-spektrofotometri.Hvis forholdet mellem OD260/280 er mellem 1,9 og 2,1, er renheden meget god.
Resterende genomisk DNA kan føre til unøjagtige kvantitative resultater
Når RNA ekstraheres, kan det RNA, vi får, blandes med genomisk DNA (gDNA), der ikke er blevet renset op.Derfor vil cDNA'et efter revers transkription også blive blandet medgDNA.Under nedstrømsqPCRreaktion,cDNAog gDNA kan amplificeres samtidigt, hvilket resulterer i en relativt lille CT-værdi, så resultaterne kan være partiske.
Så hvad skal vi gøre i denne situation?Foregeneforeslår:
(1) Udfør genomrensning på det omvendte RNA, som kan fjernes ved kolonneekstraktion under RNA-ekstraktion;
(2) Behandl det ekstraherede RNA med DNaseI , men afslut det med EDTA;
af revers transkriptionsreagensermed genom clearing moduler ;

Hvordan vælger man primere til revers transkription?
Revers transkriptionsprimere påvirker også resultatet af revers transkriptionsreaktionen.Du kan vælge tilfældige primere, Oligo dT eller genspecifikke primere til revers transkription i henhold til de specifikke omstændigheder ved eksperimentet:
(1) Specifikke udskrifter: genspecifikke primere anbefales;
(2) Lange fragmentafskrifter: Oligo dT/gen-specifikke primere anbefales;
(3) Interne fragmenter af langsegmenttranskriptioner: genspecifikke primere/ tilfældige primere/tilfældige primere + Oligo dT.Hvis det efterfølgende qPCR-eksperiment udføres, kan Oligo dT ikke bruges alene, fordi brug af Oligo dT alene kan forårsage 3′-ende-bias, hvilket fører til unøjagtige qPCR-eksperimentresultater;
(4) miRNA: Stam-loop primere eller tailing primere kan anvendes.

Hvor mange gange skal revers transkriptionsproduktets cDNA fortyndes til kvantificering?
Efter opnåelse af cDNA'et for det omvendte transkriptionsprodukt er det meget vigtigt, hvor mange gange cDNA'et skal fortyndes til qPCR-eksperimenter.Hvis cDNA-koncentrationen er for høj eller for lav, kan amplifikationseffektiviteten blive påvirket.Kan cDNA-koncentrationen måles, og hvordan skal det gøres?
(1) cDNA-koncentrationen af ​​revers transkriptionsproduktet kan ikke måles, fordi revers transkriptionsproduktet udover cDNA-produktet også indeholder revers transkriptionsrestbuffer, revers transkriptase, primere osv., som vil interferere med koncentrationsmålingsresultaterne og forårsage OD260/280, OD300/260 afspejler derfor ikke cD260-forholdet.På dette tidspunkt vil nogle venner sige, så vil jeg måle koncentrationen efter oprensning;her vil Foregene gerne minde om, at cDNA'et ikke anbefales at blive oprenset, fordi længden af ​​cDNA'et opnået ved reverseringen er forskellig, og det korte cDNA vil gå tabt i oprensningen.
(2) Hvad skal man så gøre?Før qPCR-eksperimentet kan fortyndingsgradienten af ​​cDNA'et bestemmes gennem præ-eksperimentet.For eksempel: Brug cDNA-stamopløsning, 10 gange fortynding og 100 gange fortynding som skabeloner til qPCR-eksperimenter, og vælg fortyndingsfaktoren med en CT-værdi i området 18-28.

Hvordan skal miRNA'er revers transskriberes?
miRNA er et enkeltstrenget lille molekyle RNA med en størrelse på omkring 22 nt, der ikke koder for protein.På grund af sin korte længde er konventionel qPCR-metode vanskelig at direkte kvantificere den, så det er ofte nødvendigt at udvide miRNA;de almindeligt anvendte revers transkriptionsmetoder for miRNA inkluderer stam-loop-metoden og tailing-metoden.
Stam-loop metoden er at udvide miRNA ved at tilføje stam-loop primere.Denne detektionsmetode har højere sensitivitet og specificitet, men detektionsgennemløbet er lavt.Én revers transkription kan kun detektere ét miRNA og en intern reference;haletilsætningsmetoden er sammensat af to. Den fuldendes af to enzymers fælles virkning, som er PolyA-polymerase og revers transkriptase.PolyA-polymerase er ansvarlig for at tilføje PolyA-haler til miRNA for at øge dens længde, og revers transkriptase udfører omvendt transkriptionsreaktion.Denne metode har høj detektionsgennemløb og kan detektere flere miRNA'er og interne referencer i en omvendt transkription, men sensitiviteten og specificiteten er lav i stamløkkemetoden.