Real Time PCR, også kendt som kvantitativ PCR eller qPCR, er en metode til realtidsovervågning og analyse af PCR-amplifikationsprodukter.
Fordi kvantitativ PCR har fordelene ved enkel betjening, hurtig og bekvem, høj følsomhed, god repeterbarhed og lav forureningshastighed, er den meget brugt i medicinsk testning, lægemiddeleffektivitetsvurdering, genekspressionsforskning, transgen forskning, gendetektion, patogendetektion, dyre- og plantedetektion., fødevaretestning og andre områder.
Derfor, uanset om du er beskæftiget med grundforskning inden for biovidenskab, eller ansatte i medicinalvirksomheder, dyreholdsvirksomheder, fødevarevirksomheder eller endda ansatte i ind- og udrejseinspektions- og karantænebureauer, miljøovervågningsafdelinger, hospitaler og andre enheder, vil du være mere eller mindre udsat for Eller du skal kende viden om at beherske kvantitativ PCR.

Princip for Real Time PCR

Real Time PCR er en metode, hvor fluorescerende stoffer tilsættes PCR-reaktionssystemet, og fluorescenssignalintensiteten i processen med PCR-reaktion overvåges i realtid af et kvantitativt PCR-instrument, og til sidst analyseres og behandles de eksperimentelle data.

【Amplifikationskurve】er kurven, der beskriver den dynamiske proces af PCR.Amplifikationskurven for PCR er faktisk ikke en standard eksponentiel kurve, men en sigmoid kurve.

[Platform fase af amplifikationskurve]Med stigningen i antallet af PCR-cyklusser, inaktiveringen af ​​DNA-polymerase, udtømningen af ​​dNTP'er og primere og inhiberingen af ​​syntesereaktionen af ​​reaktionsbiproduktet pyrophosphat osv., udvider PCR'en ikke altid eksponentielt., og vil til sidst komme ind på et plateau.

[Eksponentiel vækstområde for amplifikationskurve]Selvom plateaufasen varierer meget, er repeterbarheden meget god i en bestemt region af den eksponentielle vækstregion af amplifikationskurven, hvilket er meget vigtigt for kvantitativ analyse af PCR.

[Tærskelværdi og Ct-værdi]Vi sætter grænseværdien for fluorescensdetektion på den passende position i det eksponentielle vækstområde af amplifikationskurven, nemlig tærskelværdien (Threshold).Skæringspunktet mellem tærskelværdien og forstærkningskurven er Ct-værdien, det vil sige, at Ct-værdien refererer til antallet af cyklusser (Threshold Cycle), når tærskelværdien nås.

Grafen nedenfor viser tydeligt forholdet mellem tærskellinje og amplifikationskurve, tærskel og Ct-værdi.

【Hvordan kvantificerer man?】

Det er blevet bevist af matematisk teori, at Ct-værdien har et omvendt lineært forhold til logaritmen af ​​antallet af initiale skabeloner.Real Time PCR overvåger PCR amplifikationsprodukter i realtid og kvantificerer dem under den eksponentielle amplifikationsfase.

For hver PCR-cyklus steg DNA'et eksponentielt 2 gange og nåede snart et plateau.

Forudsat at mængden af ​​start-DNA er A₀ , efter n cyklusser kan den teoretiske mængde af DNA-produkt udtrykkes som:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Derefter, jo mere den initiale DNA-mængde A 0 er, jo hurtigere når mængden af ​​det amplificerede produkt detektionsværdien An, og antallet af cyklusser, når man når An er Ct-værdien.Det vil sige, at jo mere den initiale DNA-mængde A 0 er, jo tidligere topper amplifikationskurven, og tilsvarende er det nødvendige antal cyklusser n mindre.

Vi udfører gradientfortynding af standarden med kendt koncentration og bruger den som skabelon for realtids-PCR, og en række amplifikationskurver vil blive opnået med lige store intervaller i rækkefølgen af ​​start-DNA-mængde fra mere til mindre.Ifølge den lineære sammenhæng mellem Ct-værdien og logaritmen af ​​antallet af startskabeloner, a[standardkurve] kan oprettes.

Ved at erstatte Ct-værdien af ​​prøven med ukendt koncentration i standardkurven, kan den initiale skabelonmængde af prøven med ukendt koncentration opnås, hvilket er det kvantitative princip for Real Time PCR.

Detektionsmetode for Real Time PCR

Real Time PCR detekterer PCR-amplifikationsprodukter ved at detektere fluorescensintensiteten i reaktionssystemet.

Princippet for fluorescerende farveindlejringsmetode】

Fluorescerende farvestofferTB Green®, kan ikke-specifikt binde til dobbeltstrenget DNA i PCR-systemer og fluorescere ved binding.

Fluorescensintensiteten i reaktionssystemet steg eksponentielt med stigningen i PCR-cyklusser.Ved at detektere fluorescensintensiteten kan mængden af ​​DNA-amplifikation i reaktionssystemet overvåges i realtid, og derefter kan mængden af ​​startskabelonen i prøven estimeres omvendt.

【Princippet for fluorescerende probemetode】

fluorescerende sondeer en nukleinsyresekvens med en fluorescerende gruppe i 5'-enden og en quenching-gruppe i 3'-enden, som specifikt kan binde til skabelonen.Når proben er intakt, slukkes den fluorescens, der udsendes af fluoroforen, af quenching-gruppen og kan ikke fluorescere.Når proben er nedbrudt, vil det fluorescerende stof adskilles og udsende fluorescens.

En fluorescerende probe tilsættes til PCR-reaktionsopløsningen.Under annealingsprocessen vil den fluorescerende probe binde til skabelonens specifikke position.Under forlængelsesprocessen kan 5′→3′ exonukleaseaktiviteten af ​​PCR-enzymet nedbryde den fluorescerende probe hybridiseret med templaten, og det fluorescerende stof dissocieres for at udsende fluorescens.Ved at detektere fluorescensintensiteten af ​​proben i reaktionssystemet kan formålet med at overvåge amplifikationsmængden af ​​PCR-produktet opnås.

【Valg af fluorescensdetektionsmetode】

Hvis det bruges til at skelne sekvenser med høj homologi og udføre multipleks PCR-detektion, såsom SNP-typeanalyse, er fluorescerende probemetoden uerstattelig.
Til andre Real Time PCR-eksperimenter kan en enkel, nem og billig fluorescerende kimærmetode bruges.

prober Stærk specificitet, i stand til multipleks PCR

Mangel

Høje specificitetskrav til amplifikation;

multiplex PCR kan ikke udføres Behov for at designe specifikke prober, høje omkostninger;

nogle gange er probedesign svært

Relaterede produkter: