RNase er et følsomt ord, som mange studerende, der ofte udfører RNA-ekstraktionsforsøg, ikke ønsker at høre.Fuldt bevæbnet blev det RNA, der til sidst blev ekstraheret med de meget giftige reagenser phenol og chloroform, nedbrudt.Jeg er ikke forsonet!!!Lad os i dag tage et kig på oprindelsen af ​​den berømte Rnase.

Ribonuklease (RNase), eller RNase, er en nuklease, der kan hydrolysere RNA til små molekyler.RNase, som et lille molekyleprotein, er usædvanligt stabilt .Konventionel højtemperatur- og højtryksdampsterilisering og proteininhibitorer kan ikke inaktivere den fuldstændigt.Stabiliteten af ​​RNase kommer hovedsageligt fra disulfidbindingerne i strukturen.For eksempel har den almindeligt anvendte RNase fra bovin bugspytkirtel kun 124 aminosyrer, men indeholder 4 disulfidbindinger.Svovlbinding og disulfidbinding giver RNase fremragende termisk stabilitet.Derudover har rnase en relativt lille molekylvægt og kan hurtigt genoprette sin oprindelige konformation i mange tilfælde.

Ud over at være ekstremt stabil,RNaser er allestedsnærværende i laboratoriet .RNase er en biologisk forsvarsmekanisme.For en celle er eksogent RNA ofte dødeligt.Sammenlignet med eksogent DNA er eksogent RNA ofte mere farligt.RNA transskriberes og oversættes med glæde, så næsten alle organismer har udviklet RNaser for at forsvare sig mod invasionen af ​​eksogent RNA.Derfor udstråler de bakterieceller, der dyrkes i laboratoriet, og dig, der udvinder RNA, duften af ​​RNase.Menneskelige kropsvæsker (spyt, tårer osv.) indeholder en stor mængde RNase, så græd ikke, når RNA nedbrydes.Jo mere du græder, jo værre bliver RNA-nedbrydningen!!Søster Daiyu er ikke egnet til RNA-ekstraktion!

Derudover indeholder din sarte hud også en masse RNase, og de tuscher, pipetter, køleskabsdøre og dørhåndtag, der er blevet berørt af huden, indeholder også RNase.

Med så meget travlhed, lad os tage et kig på, hvordan man håndterer RNaser.

Den første ting, som alle tænker på, når de fjerner RNA, erDEPC(diethylpyrocarbonat).DEPC denaturerer hovedsageligt proteinet ved at kombinere med imidazolringen af ​​den aktive RNase-gruppe histidin, hvorved enzymets aktivitet hæmmes.0,1% DEPC kan have en bedre fjernelseseffekt på RNase, men vi skal være opmærksomme på, at DEPC er et kendt kræftfremkaldende stof, så der skal lægges særlig vægt på at bruge det.

For RNase skal vi tage udgangspunkt i to aspekter,den første er at hæmme aktiviteten af ​​endogen RNase

Konventionelle RNA-ekstraktionsreagenser såsom guanidinisothiocyanat og DTT indeholdt i Trizol kan åbne disulfidbindingen af ​​RNase, men der er stadig nogle RNaser, især i vævsprøver, så vær opmærksom på lav temperatur.

1.Nedsænk straks vævsprøven i flydende nitrogen, efter at den er taget ud, eller i en kommerciel RNA-konserveringsopløsning.

2.Efter at have ekstraheret RNA'et fra celleprøven, tilsæt det til lysisopløsningen og lysér det på isboksen

3. Det er bedst at bruge flydende nitrogen til slibning når vævsprøver homogeniseres.Når du bruger en elektrisk homogenisator uden flydende nitrogen, skal du være opmærksom på at forkøle homogenatadapteren fuldstændigt.

Den anden er eksogen DNase

1.Vær fuldt bevæbnet, tag laboratoriefrakke på, tag maske på, og sørg for at have et par nye handsker på (vær ikke så sparsommelig!! Det skal bemærkes, at Trizol er superætsende, og det er også meget stærkt gennem handsker, så dryp ikke på hænderne).

2.Alle de brugte pipettespidser, EP-rør, PCR-rør og andet udstyr skal de-RNase-behandles.Den kan lægges i blød i 0,1% DEPC og derefter sættes under højt tryk.Vær opmærksom på betjeningen i et stinkskab.Lokale tyranner kan direkte købe forbrugsvarer til at fjerne enzymer.

PS: Lad mig fortælle dig en doven metode.Selvom høj temperatur og højt tryk ikke helt kan fjerne RNase, vil det fjerne en stor del af det.2 gange høj temperatur og højt tryk har en god effekt, og ekstraktion af RNA har ringe effekt.

3.Alkohol kan denaturere proteiner,så RNA-ekstraktionsbordet kan tørres af med 75 % alkohol , og handsker kan også sprøjtes med alkohol.

4.Den endelige RNA-opløsningsopløsning og centrifugerøret bør også de-RNase-behandles.DEPC-vand er en almindeligt anvendt RNA-opløsningsopløsning.Lad os tale om den korrekte fremstillingsmetode for DEPC-vand (husk at ompakke den kommercielle DEPC, når du køber den)

Tilsæt DEPC til ultrarent vand ved 1:1000, ryst godt, lad stå natten over ved 37°C og steriliser ved 121°C under høj temperatur og højt tryk i 15 minutter.DEPC-vand kan opbevares ved -20°C i 1 ml alikvoter.

Til sidst, for at opsummere: lav temperatur er nøglen, forbrugsstoffer håndteres godt, fuldt bevæbnet og mindre snak!

Nå, det er det for dagens strategi.Jeg ønsker dig al den RNA-koncentration og renhed, du nævnte.Begge A260/A280 er 2.0!!!

Selvfølgelig, hvis du bruger enstuetemperaturdrift RNA-ekstraktionssæt, vil du muligvis ikke støde på ovenstående problemer.

Drift ved stuetemperatur uden tilsætning af DNase ekstraherer totalt RNA fra celler på 11 minutter og ekstraherer totalt RNA fra dyrevæv eller planter på 30 minutter.

For prøveprøver, kontakt venligst:overseas@foregene.com

Relaterede produkter:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/