Traditionelle reverse transkriptaser kan ikke tolerere høje temperaturer (den optimale temperatur for MMLV-aktivitet er 37-50°C, og AMV er 42-60°C).Det mere komplekse virale RNA kan ikke effektivt revers transkriberes til cDNA ved lave temperaturer, hvilket resulterer i detektionseffektivitet. Reduktionen.Traditionel RT-qPCR kræver generelt deltagelse af to nøgleenzymer (revers transkriptase og DNA-polymerase), hvilket gør det umuligt at forenkle driften af ​​reaktionssystemet og reducere omkostningerne.Her vil vi introducere to højtemperatur-resistente reverse transkriptaser, TtH og RevTaq.Disse to enzymer har også funktionen af ​​DNA-polymerase, så de kaldes bifunktionelle enzymer.

TtH DNA polymerase

Du har sikkert hørt om TtH, som stammer fra den termofile bakterie Thermus thermophilus HB8.I nærvær af divalente kationer, såsom Mg2+, har det DNA-polymeraseaktivitet.Det er meget udbredt i PCR-reaktioner som Taq-enzym, men det har højere varmebestandighed end Taq-enzym, så det har også en bedre effekt på PCR med skabeloner med højt GC-indhold.

· Dette enzym har som udgangspunkt ingen 3′→5′ exonukleaseaktivitet og 5′→3′ exonukleaseaktivitet, så det kan også bruges til dideoxysekventering.

· Dette enzym har RTase-aktivitet.I nærvær af Mn2+ vil RTase-aktivitet blive forstærket.Ved at bruge denne funktion kan den bruges til at udføre omvendt transkriptionsreaktion og PCR-reaktion i det samme rør, det vil sige et-trins RT-PCR.I nærvær af Mn2+ er nøjagtigheden af ​​RT-PCR imidlertid ikke høj.RT-aktivitet har intet at gøre med rnaase H-aktivitet.

· Den øgede aktivitet af Tth-DNA-polymerase (pH9, optimal +55℃～+70℃, maksimum +95℃) overvinder problemerne forårsaget af RNA-sekundær struktur.Det resulterende cDNA kan amplificeres ved PCR med det samme enzym i nærvær af Mg2+ ioner.

· Tth-DNA-polymerases evne til at udføre revers transkription og DNA-amplifikation ved høje temperaturer gør dette enzym nyttigt til kvantitativ RT-PCR, kloning og genekspressionsanalyse af cellulært og viralt RNA.
· Tth-DNA-polymerase bruges til RT-PCR til at amplificere RNA op til 1 kb.

Egenskaber og fordele

Tth DNA polymerase:

• Sikre den optimerede polymerasekædereaktion (PCR) produktstørrelse, mindst 1000 bp i RT-PCR-reaktionen

• Accepter modificeret deoxyribonukleosidtrifosfat som et substrat

• Ikke relateret til RNase H-aktivitet

• Har høj termisk stabilitet til at overvinde problemer, normalt relateret til den høje sekundære struktur, der er til stede i RNA

RevTaq RT-PCR DNA-polymerase

En varmeresistent DNA-polymerase med revers transkriptaseaktivitet

RevTaq-RT-PCR-DNA-polymerase er et konstrueret, meget varmebestandigt, dobbeltfunktionelt enzym med revers transkriptase- og DNA-polymeraseaktiviteter opnået gennem rettet og kunstig evolution.

· Halveringstiden for RevTaq RT-PCR DNA-polymerase ved 95°C er mere end 40 minutter.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymerase tillader højtemperatur revers transkription direkte fra RNA-skabelonen, og revers transkriptionstrinnet kan gentages flere gange for at generere flere cDNA-skabeloner.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymerase tillader "nultrins" RT-PCR (ingen isotermisk revers transkriptionstrin), fordi i det cykliske PCR-forlængelsetrin forekommer revers transkription og DNA-amplifikation samtidigt.Dette fremmer også den omvendte transkriptionsreaktion ved høje temperaturer og minimerer derved de problemer, man støder på ved smeltning af den stærke sekundære struktur i RNA ved høje temperaturer.

· På grund af den aptamer-baserede hot-start-formel vil RevTaq RT-PCR DNA-polymerase give bedre resultater, når annealings- og forlængelsestemperaturen er højere end 57°C.

· Da enzymet er varmebestandigt, anbefales det at designe primere og prober med meget høje smeltepunkter (>60°C).

· Det anbefales at optimere temperaturen på udglødnings-/forlængelsetrinnet gennem en temperaturgradient under reaktionsopsætningsprocessen.

· Jo højere temperatur, jo højere specificitet af PCR.Den omvendte transkriptionscyklus udføres normalt ved en højere temperatur end PCR-cyklussen, fordi DNA Primer:RNA Template-hybridisering normalt har et højere smeltepunkt end DNA Primer:cDNA Template-dupleks.

· RevTaq RT-PCR DNA-polymerase er gensplejset og optimeret, og amplikonstørrelsen er mellem 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNA polymerase detektionsgrænsen når 4 kopier/

Det optimerede reaktionssystem (etablering af primere med højt smeltepunkt) er vist i figuren.RevTaq RT-PCR DNA-polymerase-drevet RT-PCR viser bedre følsomhed end TaqPath 1-trins RT-qPCR mastermix og lavere detektion Prøvefortyndingsgradient.

Flere fordele:

Hurtig startfunktion → Det indledende termiske denatureringstrin kan springes over.

Hot-start aptamer formel → Giv 100 % enzymaktivitet med det samme og forhindre uspecifik amplifikation ved lave temperaturer (<57°C).

Spaltningsfunktion → RNA-ekstraktionstrinnet er udeladt, fordi RevTaq RT-PCR DNA-polymerase også kan behandle rå reaktionsprøver.Det kan øjeblikkeligt ødelægge cellemembranerne af eukaryoter, bakterier og vira i en varm RT-PCR-cyklus.

IVD råvareniveau → høje kvalitetsstandarder og yderst konkurrencedygtige priser