Tips til forbedring af limgenvinding

1. Forøg prøvebelastningen under elektroforese.

2. Brug frisklavet elektroforesebuffer.

3. Når du skærer lim, prøv kun at skære limen med strimler for at reducere volumen af ​​limskæring: du behøver ikke lim med få formålsfragmenter, ellers vil det påvirke genvindingsgraden.

4. Efter at have smeltet to eller flere stykker lim, skal du bruge et rør, uanset hvor stort volumen er, og overføre det til samme søjle.

5. Opløsningen tilsat i solen kan være lidt mere, hvilket er mere befordrende for bindingen af ​​DNA til membranen, men overstiger generelt ikke 750ul.

6. Nøglen til gelgenvinding er at binde DNA til søjlen gennem saltkoncentrationen, surhedsgraden (ladningen) og hydrofobiciteten af ​​opløsningen i søjlen.Derfor, hvis pH-værdien af ​​elektroforesebufferen er for høj, kan 10 ul (pH 5,0, 3 mol/L NaAC) tilsættes til solen;for bedre at opsnappe DNA-molekyler på membranen, kan 30% isopropanol tilsættes til opvarmning i væsken efter opløsning af limen.

7. Før eluenten tilsættes, lad kolonnen stå ved stuetemperatur i et par minutter (ca. 10 minutter) for at fordampe ethanolen fuldstændigt.

8. Tilsæt til sidst mindre eluent for at minimere genvindingsvolumenet.Generelt bruges 30-50μl eluent til eluering (ikke for lidt, ellers vil det ikke være i stand til at fugte membranen, hvilket ikke er befordrende for eluering);elueringsdråberne er i midten af ​​membranen for fuldt ud at eluere DNA'et bundet til membranen.

9. Efter tilsætning af eluenten kan den elueres i et vandbad på 55 grader i 5 minutter eller placeres i et vandbad på 50 grader i mere end 10 minutter, eller forsegles med en parafilm ved 4 grader natten over, og derefter centrifugeres til genvinding næste dag, effekten er god.

10. Tilsæt det centrifugerede eluat tilbage til adsorptionssøjlen og centrifuger igen.

Detaljerede metoder og procedurer til gendannelse af PCR-produkter

1. Almindelig gummigenbrug

Hvis du vil genvinde limen, er det bedst at bruge et kit, som er praktisk og har en lidt højere genvindingsgrad.Hvis du virkelig har brug for at gendanne det manuelt, kan du tilføje 3 gange volumen af ​​TE efter at have skåret limen.Efter smeltning i vandbad ekstraheres phenol, phenol/chloroform rent, og ethanol udfældes.Det er det.

2. DNA-genvinding fra geler med lavt smeltepunkt

Oprensning af DNA-fragmenter Tilsæt TE (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA) svarende til volumenet af gelen, og anbring i et 65°C vandbad i 5 minutter for at opløse gelen fuldstændigt.

Efter at det var bragt til stuetemperatur, blev en lige stor mængde phenol (mættet med TE, TE forseglet i det øvre lag, og det nederste lag af phenol blev fjernet) tilsat, og blandingen blev forsigtigt blandet (ingen blanding påkrævet) og centrifugeret ved 12.000 rpm i 3 minutter.Gentag 1-2 gange.

Tag supernatanten, tilsæt 0,1 volumen 3mol/L natriumacetat (pH 5,2) og 2,5 gange volumen absolut ethanol for at udføre ethanolfældning.Opløs det oprensede DNA med en passende mængde TE, mål indholdet og klargør til brug (det kan bruges til målgenstrukturanalyse, probeforberedelse osv.).

3. PCR-genvinding med god amplifikationsspecificitet

Hvis specificiteten af ​​PCR-amplifikation er god, er det blot en simpel oprensning og genvinding af PCR-produktet.Du kan tilføje 50 ug/ml proteinase K til PCR-produktet, 37 grader i 1 time, ekstrahere én gang med phenol/chloroform, ekstrahere én gang med chloroform og tilsætte 0,1 volumen af ​​supernatanten.Natriumacetatet blev udvundet ved præcipitation med 2,5 volumener absolut ethanol.

Relaterede produkter:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/