COVID-19 er en infektionssygdom forårsaget af alvorligt akut respiratorisk syndrom Coronavirus Type 2. Når en person er smittet, er de mest almindelige symptomer feber, hoste og åndenød.

Prøverne, der bruges til testning, kan indsamles med nasopharyngeale podninger eller oropharyngeale podninger.

Hvad er PCR?

Standardmetoden til påvisning af coronavirus er polymerasekædereaktion, PCR.Dette er en metode, der er meget udbredt i molekylærbiologi.Det kan hurtigt kopiere millioner til milliarder af specifikke DNA-fragmenter.

Den nye coronavirus indeholder et meget langt enkeltstrenget RNA-genom.For at påvise disse vira ved PCR, skal RNA-molekyler omdannes til deres komplementære DNA-sekvenser ved hjælp af revers transkriptase, og derefter kan det nysyntetiserede DNA amplificeres ved standard PCR-procedurer, som er almindeligt kendt som RT-PCR.

RT-PCR proces

RNA-ekstraktion

For at udføre denne metode skal viralt RNA som udgangspunkt ekstraheres.En række forskellige RNA-oprensningssæt kan bruges til bekvem, hurtig og effektiv adskillelse.

For at ekstrahere viralt RNA ved hjælp af et kommercielt sæt skal du først tilføje prøven til et mikrocentrifugerør og derefter blande den med lysisbufferen.Denne buffer er stærkt denatureret og består normalt af phenol og guanidin isothiocyanat.Derudover er RNase-hæmmere sædvanligvis til stede i lysisbufferen for at sikre isolering af intakt viralt RNA.

Efter tilsætning af lysisbufferen, vortex blandingsrøret med puls og inkuber ved stuetemperatur.Virusset lyseres derefter under stærkt denaturerende betingelser tilvejebragt af lysisbufferen.

Efter at prøven er lyseret, bruges et centrifugerør til oprensningsproceduren.Prøven fyldes i centrifugerøret og centrifugeres derefter.

Denne procedure er en fastfaseekstraktionsmetode, hvor den stationære fase består af en silicagelmatrix.

Under optimale salt- og pH-forhold binder RNA-molekyler sig til silicamembranen.

Samtidig fjernes protein og andre forurenende stoffer.

Efter centrifugering placeres centrifugerøret i et rent opsamlingsrør, filtratet kasseres, og vaskebuffer tilsættes.

Placer røret i centrifugen igen for at tvinge vaskebufferen gennem membranen.Dette vil fjerne alle resterende urenheder fra membranen og efterlade kun RNA'et bundet til silicagelen.

Efter at prøven er vasket, sættes røret i et rent mikrocentrifugerør og elueringsbufferen tilsættes.

Den centrifugeres derefter for at tvinge elueringsbufferen gennem membranen.Elueringsbufferen fjerner viralt RNA fra spinsøjlen og opnår oprenset RNA fri for proteiner, inhibitorer og andre kontaminanter.

TRIN 2

Blandet koncentrat

Efter ekstraktion af det virale RNA er det næste trin at forberede reaktionsblandingen til PCR-amplifikation.I dette trin anvendes koncentrat.Denne koncentrerede opløsning er en forblandet koncentreret opløsning, der består af en præmix, revers transkriptase, nukleotider, forward primer, reverse primer, TaqMan-probe og DNA-polymerase.

Til sidst, for at fuldende denne reaktionsblanding, tilsættes RNA-skabelonen.Rørene blandes ved pulsvortexing, og derefter fyldes reaktionsblandingen i PCR-pladen.PCR-pladen indeholder normalt 96 brønde og kan analysere flere prøver på samme tid.

TRIN 3

PCR-amplifikation

Placer derefter pladen i PCR-maskinen, som i det væsentlige er en termisk cykler.

Real-time RT-PCR bruges til at detektere det nye coronavirus fra 2019 ved at amplificere målsekvensen i RdrRP-genet, E-genet og N-genet.Valget af målgen afhænger af primeren og probesekvensen.

Det første trin af RT-PCR er revers transkription.Den første streng af komplementært DNA syntetiseres, som initieres af PCR reverse primeren, som binder til den komplementære del af det virale RNA-genom.Derefter tilføjer revers transkriptase DNA-nukleotider til 3'-enden af ​​primeren for at syntetisere DNA komplementært til det virale RNA.Temperaturen og varigheden af ​​dette trin afhænger af de anvendte primere, mål-RNA og revers transkriptase.

Dernæst påføres et indledende denatureringstrin, som resulterer i denatureringen af ​​RNA-DNA-hybriden.Dette trin er nødvendigt for at aktivere DNA-polymerasen.Samtidig inaktiveres revers transkriptase.

PCR består af en række termiske cyklusser.Hver cyklus består af denaturerings-, annealings- og forlængelsestrin.

Denatureringstrinnet involverer opvarmning af reaktionskammeret til 95 grader Celsius og brug af det til denaturering af den dobbeltstrengede DNA-skabelon.

I det næste trin reduceres reaktionstemperaturen til 58 grader Celsius, hvilket tillader den fremadrettede primer at anneale til den komplementære del af dens enkeltstrengede DNA-skabelon.Udglødningstemperaturen afhænger direkte af primerens længde og sammensætning.

I forlængelsestrinnet syntetiserer DNA-polymerasen en ny DNA-streng, der er komplementær til DNA-templatestrengen.Ved at tilføje frie kerner komplementære til skabelonen i 5'- til 3'-retningen fra reaktionsblandingen.Temperaturen på dette trin afhænger af den anvendte DNA-polymerase.

Efter den første cyklus opnås et dobbeltstrenget DNA-mål.

Gå derefter ind i den anden cyklus.Det dobbeltstrengede DNA denatureres for at producere to enkeltstrengede DNA-molekyler.

I det næste trin sænkes reaktionstemperaturen, primerne anneales til hver enkeltstrenget DNA-skabelon, og Taq-man-proben anneales til den komplementære del af mål-DNA'et.

TaqMan-proben består af en fluorofor kovalent bundet til 5'-enden af ​​oligonukleotidproben.Når den exciteres af lyskilden fra cycleren, udsender fluoroforen fluorescens.Derudover er sonden sammensat af en quencher i 3′enden.Nærheden af ​​reportergenet til quencheren forhindrer påvisning af fluorescens.

I forlængelsestrinnet syntetiserer DNA-polymerasen en ny streng.Når polymerasen når TaqMan-proben, spalter dens endogene 5'-nukleaseaktivitet proben og adskiller farvestoffet fra quencheren.

Med hver PCR-cyklus frigives flere farvestofmolekyler, hvilket resulterer i en stigning i fluorescensintensitet proportional med antallet af syntetiserede amplikoner.

Denne metode gør det muligt at estimere antallet af en given sekvens til stede i prøven.Antallet af dobbeltstrengede DNA-fragmenter fordobles i hver cyklus.Derfor kan PCR bruges til at analysere meget små prøver.

Til måling af fluorescerende signal, wolfram-halogenlampe, excitationsfilter, reflektor, linse, emissionsfilter og ladekoblet enhed-brug CCD-kamera.

TRIN 4 Registrer

Til måling af fluorescerende signal, wolfram-halogenlampe, excitationsfilter, reflektor, linse, emissionsfilter og ladekoblet enhed-brug CCD-kamera.

Det filtrerede lys fra lampen reflekteres af reflektoren, passerer gennem kondensatorlinsen og fokuseres til midten af ​​hvert hul.Derefter reflekteres fluorescensen, der udsendes fra hullet, fra spejlet, passerer gennem emissionsfilteret og detekteres af CCD-kameraet.I hver PCR-cyklus kan det selvexciterede fluoroforlys detekteres af CCD'en.

Det konverterer det opfangede lys til digitale data.Denne metode kaldes real-time PCR, og den giver mulighed for real-time overvågning af PCR-reaktionens fremskridt.