PCR (polymerasekædereaktion) er en af ​​in vitro DNA-amplifikationsteknologierne med en historie på mere end 30 år.

PCR-teknologien blev udviklet af Kary Mullis fra Cetus, USA i 1983. Mullis ansøgte om et PCR-patent i 1985 og udgav det første PCR-akademiske papir om videnskab samme år.Mullis blev tildelt Nobelprisen i kemi i 1993 for sit arbejde.

Grundlæggende principper for PCR

PCR kan amplificere mål-DNA-fragmenter mere end en million gange.Princippet er under katalyse af DNA-polymerase ved at bruge stamstrengs-DNA som skabelon og specifik primer som udgangspunkt for forlængelse.Det replikeres in vitro gennem trin som denaturering, annealing og forlængelse.Processen med datterstrengs-DNA, der er komplementær til stamstrengskabelon-DNA'et.

Standard PCR-processen er opdelt i tre trin:

1.Denaturering: Brug høj temperatur til at adskille DNA-dobbeltstrenge.Hydrogenbindingen mellem DNA-dobbeltstrenge brydes ved høj temperatur (93-98 ℃).

2.Annealing: Efter at det dobbeltstrengede DNA er adskilt, sænkes temperaturen, så primeren kan binde til det enkeltstrengede DNA.

3. Forlængelse: DNA-polymerasen begynder at syntetisere komplementære strenge langs DNA-strengene fra de bundne primere, når temperaturen sænkes.Når forlængelsen er afsluttet, afsluttes en cyklus, og antallet af DNA-fragmenter fordobles

Ved at gentage disse tre trin 25-35 gange vil antallet af DNA-fragmenter stige eksponentielt.

Opfindsomheden ved PCR er, at forskellige primere kan designes til forskellige målgener, således at målgenfragmenter kan amplificeres på kort tid.

Indtil videre kan PCR opdeles i tre kategorier, nemlig almindelig PCR, fluorescerende kvantitativ PCR og digital PCR.

Den første generation af almindelig PCR

Brug et almindeligt PCR-amplifikationsinstrument til at amplificere målgenet, og brug derefter agarosegelelektroforese til at påvise produktet, kun kvalitativ analyse kan udføres.

De vigtigste ulemper ved den første generation af PCR:

1. Tilbøjelig til ikke-specifik amplifikation og falsk positive resultater.

2.Detekteringen tager lang tid, og operationen er besværlig.

3.Kun kvalitativ test kan udføres

Anden generation Real-Time PCR

Real-Time PCR, også kendt som qPCR, bruger fluorescerende prober, der kan indikere reaktionssystemets fremskridt, og overvåger akkumuleringen af ​​amplificerede produkter gennem akkumulering af fluorescerende signaler og bedømmer resultaterne gennem fluorescenskurven.Det kan kvantificeres ved hjælp af Cq-værdi og standardkurve.

Fordi qPCR-teknologien udføres i et lukket system, reduceres sandsynligheden for kontaminering, og fluorescenssignalet kan overvåges for kvantitativ påvisning, så det er den mest udbredte i klinisk praksis og er blevet den dominerende teknologi inden for PCR.

De fluorescerende stoffer, der anvendes i real-time fluorescerende kvantitativ PCR, kan opdeles i: TaqMan fluorescerende probe, molekylære beacons og fluorescerende farvestof.

1) TaqMan fluorescerende sonde:

Under PCR-amplifikation tilføjes en specifik fluorescerende probe, mens der tilføjes et par primer.Proben er et oligonukleotid, og begge ender er mærket med en reporter-fluorescerende gruppe og en quencher-fluorescerende gruppe.

Når proben er intakt, absorberes det fluorescerende signal, der udsendes af reportergruppen, af quenching-gruppen;under PCR-amplifikation spalter og nedbryder 5'-3' exonukleaseaktiviteten af ​​Taq-enzymet proben, hvilket gør reporteren til fluorescerende gruppe og quencher. Den fluorescerende gruppe adskilles, så fluorescensovervågningssystemet kan modtage fluorescenssignalet, dvs. hver gang en DNA-streng akkumuleres, fluorescerende forstærkes, fluorescerende og fluorescerende. cence-signalet er fuldstændig synkroniseret med dannelsen af ​​PCR-produktet.

2) SYBR fluorescerende farvestof:

I PCR-reaktionssystemet tilsættes et overskud af SYBR fluorescerende farvestof.Efter at SYBR-fluorescerende farvestof er ikke-specifikt inkorporeret i DNA-dobbeltstrengen, udsender det et fluorescerende signal.SYBR-farvestofmolekylet, der ikke er inkorporeret i kæden, vil ikke udsende noget fluorescerende signal, hvilket sikrer det fluorescerende signal. Stigningen i PCR-produkter er fuldstændig synkroniseret med stigningen i PCR-produkter.SYBR binder kun til dobbeltstrenget DNA, så smeltekurven kan bruges til at bestemme, om PCR-reaktionen er specifik.

3) Molekylært fyrtårn:

Det er en stamløkke dobbeltmærket oligonukleotidprobe, der danner en hårnålestruktur på omkring 8 baser ved 5 og 3 enderne.Nukleinsyresekvenserne i begge ender er komplementært parrede, hvilket forårsager, at den fluorescerende gruppe og den quenchende gruppe er tætte.Luk, der vil ikke blive produceret fluorescens.

Efter at PCR-produktet er genereret, under annealingsprocessen, parres den midterste del af det molekylære beacon med en specifik DNA-sekvens, og det fluorescerende gen adskilles fra quencher-genet for at producere fluorescens.

De største ulemper ved anden generation af PCR:

Følsomheden mangler stadig, og detektionen af ​​prøver med lavt antal kopier er unøjagtig.

Der er indflydelse af baggrundsværdien, og resultatet er modtageligt for interferens.

Når der er PCR-hæmmere i reaktionssystemet, er påvisningsresultaterne modtagelige for interferens.

Tredje generation digital PCR

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) beregner kopitallet for målsekvensen gennem endepunktsdetektion og kan udføre nøjagtig absolut kvantitativ detektion uden brug af interne kontroller og standardkurver.

Digital PCR bruger endepunktsdetektion og afhænger ikke af Ct-værdien (cyklustærskel), så den digitale PCR-reaktion påvirkes mindre af amplifikationseffektiviteten, og tolerancen over for PCR-reaktionshæmmere er forbedret med høj nøjagtighed og reproducerbarhed.

På grund af egenskaberne ved høj følsomhed og høj nøjagtighed forstyrres den ikke let af PCR-reaktionshæmmere, og den kan opnå ægte absolut kvantificering uden standardprodukter, som er blevet et forsknings- og anvendelseshotspot.

I henhold til reaktionsenhedens forskellige former kan den opdeles i tre hovedtyper: mikrofluidiske, chip- og dråbesystemer.

1) Mikrofluidisk digital PCR, mdPCR:

Baseret på den mikrofluidiske teknologi adskilles DNA-skabelonen.Den mikrofluidiske teknologi kan realisere prøven nano-opgradering eller generering af mindre dråber, men dråberne har brug for en speciel adsorptionsmetode og derefter kombineret med PCR-reaktionssystemet.mdPCR er gradvist blevet vedtaget af andre metoder erstatte.

2) Dråbebaseret digital PCR, ddPCR:

Brug vand-i-olie dråbegenereringsteknologi til at behandle prøven til dråber, og opdel reaktionssystemet, der indeholder nukleinsyremolekyler, i tusindvis af nanoskala dråber, som hver især ikke indeholder det nukleinsyremålmolekyle, der skal detekteres, eller indeholder et til flere nukleinsyremålmolekyler, der skal testes.

3) Chip-baseret digital PCR, cdPCR:

Brug den integrerede væskebaneteknologi til at indgravere mange mikrorør og mikrohulrum på siliciumwafers eller kvartsglas, og kontroller strømmen af ​​opløsningen gennem forskellige kontrolventiler, og opdel prøvevæsken i nanometer af samme størrelse i reaktionsbrøndene til digital PCR-reaktion for at opnå absolut kvantificering.

De største ulemper ved den tredje generation af PCR:

Udstyret og reagenserne er dyre.

Skabelonens kvalitetskrav er høje.Hvis skabelonmængden overstiger mikrosystemmængden, vil den være umulig at kvantificere, og hvis den er for lille, vil kvantificeringsnøjagtigheden blive reduceret.

Falske positive kan også genereres, når der er ikke-specifik amplifikation.