PCR er den mest udbredte nukleinsyreamplifikationsteknologi og er meget udbredt på grund af dens sensitivitet og specificitet.Men PCR kræver gentagen termisk denaturering og kan ikke slippe af med begrænsningerne ved at stole på instrumenter og udstyr, hvilket begrænser dets anvendelse i kliniske felttest.

Siden begyndelsen af ​​1990'erne er mange laboratorier begyndt at udvikle konstant temperatur amplifikationsteknologi, der ikke kræver termisk denaturering.Nu har de udviklet loop-medieret isotermisk amplifikationsteknologi, strengerstatning isotermisk amplifikationsteknologi, rullende cirkel isotermisk amplifikationsteknologi og nukleinsyresekvensafhængighed.Isotermisk forstærkningsteknologi og andre teknologier. 

Loop-medieret isotermisk amplifikation

Amplifikationsprincippet er baseret på det faktum, at DNA er i en dynamisk ligevægtstilstand ved ca. 65°C.Når en hvilken som helst primer er baseparret og udvidet til den komplementære del af dobbeltstrenget DNA, vil den anden streng dissociere og blive enkeltstrenget.

Ved denne temperatur bruger DNA 4 specifikke primere til at stole på en streng-fortrængnings-DNA-polymerase for at få syntesen af ​​streng-fortrængnings-DNA til at selvcirkulere kontinuerligt.

Bestem først de 6 specifikke regioner F3, F2, F1, B1, B2, B3 på målgenet, og design derefter 4 primere baseret på disse 6 specifikke regioner (som vist i figuren nedenfor):

Den forreste indre primer (FIP) er sammensat af F1c og F2.

Den bagudrettede indre primer (BIP) er sammensat af B1c og B2, og TTTT bruges som spacer i midten.

De ydre primere F3 og B3 er henholdsvis sammensat af F3- og B3-regioner på målgenet.

I LAMP-reaktionssystemet er koncentrationen af ​​den indre primer flere gange så stor som den ydre primer.Den indre primer kombineres først med skabelonstrengen for at syntetisere en komplementær streng for at danne en DNA-dobbeltstreng.Efterfølgende kombineres den ydre primer med skabelonstrengen for at danne en DNA-dobbeltstreng.Under påvirkning af BstDNA-polymerase frigives den komplementære streng syntetiseret af den indre primer.Efter en række reaktioner danner den komplementære streng endelig en enkelt DNA-streng med en håndvægtstruktur.

Håndvægtstrukturen DNA-enkeltstreng i sig selv bruges som skabelon til kontinuerligt at danne et overgangsstamme-løkkestruktur-DNA med en åben ende.De indre og ydre primere leder overgangsstammen-løkkestruktur-DNA'et til kontinuerligt at gennemgå strengforskydnings- og forlængelsesreaktioner og til sidst danner multiple stamløkkestrukturer med forskellige længder.DNA blanding.

Fordele og ulemper ved loop-medieret isotermisk amplifikation

Fordele ved LAMP:

(1) Høj amplifikationseffektivitet, som effektivt kan amplificere 1-10 kopier af målgenet inden for 1 time, og amplifikationseffektiviteten er 10-100 gange større end almindelig PCR.

(2) Reaktionstiden er kort, specificiteten er stærk, og der kræves intet specielt udstyr.

Mangler ved LAMP:

(1) Kravene til primere er særligt høje.

(2) Det amplificerede produkt kan ikke bruges til kloning og sekventering, men kan kun bruges til bedømmelse.

(3) På grund af dens stærke følsomhed er det let at danne aerosoler, hvilket forårsager falske positiver og påvirker testresultaterne.

Strådforskydningsforstærkning

Strand displacement amplification (SDA) er en in vitro isotermisk DNA-amplifikationsteknik baseret på enzymatisk reaktion først foreslået af den amerikanske forsker Walker i 1992.

Det grundlæggende system af SDA omfatter en restriktionsendonuklease, en DNA-polymerase med strengforskydningsaktivitet, to par primere, dNTP'er og calcium- og magnesiumioner og buffersystemer.

Princippet for strengforskydningsamplifikation er baseret på den kemisk modificerede restriktionsendonuklease-genkendelsessekvens i begge ender af mål-DNA'et.Endonukleasen åbner hullet i streng-DNA'et ved dets genkendelsessted, og DNA-polymerasen udvider mellemrummet 3'-enden og erstatter den næste DNA-streng.

De erstattede enkeltstrenge af DNA kan kombineres med primere og forlænges til dobbeltstrenge ved hjælp af DNA-polymerase.Denne proces gentages kontinuerligt, således at målsekvensen effektivt amplificeres.

Fordele og ulemper ved strengforskydningsteknologi

Fordele ved SDA:

Amplifikationseffektiviteten er høj, reaktionstiden er kort, specificiteten er stærk, og der kræves intet specielt udstyr.

Mangler ved SDA:

Produkterne er ikke ensartede, og nogle enkeltstrengede og dobbeltstrengede produkter produceres altid i SDA-cyklussen, og tailing vil uundgåeligt forekomme, når det påvises ved elektroforese.

Rolling cirkel forstærkning

Rolling circle amplification (RCA) foreslås ved at trække på metoden til kopiering af DNA fra patogene organismer ved rullende cirkel.Det refererer til brugen af ​​enkeltstrenget cirkulært DNA som skabelon ved konstant temperatur og en speciel DNA-polymerase (såsom Phi29) ) Under påvirkning af rullende cirkel-DNA-syntese for at opnå amplifikation af målgenet.

RCA kan opdeles i lineær amplifikation og eksponentiel amplifikation.Effektiviteten af ​​lineær RCA kan nå 10⁵gange, og effektiviteten af ​​eksponentiel RCA kan nå 10⁹gange.

Simpel skelnen, som vist i figuren nedenfor, bruger lineær amplifikation a kun 1 primer, eksponentiel amplifikation b har 2 primere.

Lineær RCA kaldes også single primer RCA.En primer binder til cirkulært DNA og forlænges ved virkningen af ​​DNA-polymerase.Produktet er en lineær enkeltstreng med et stort antal gentagne sekvenser tusindvis af gange længden af ​​en enkelt sløjfe.

Da produktet af lineær RCA altid er forbundet til startprimeren, er den lette fiksering af signalet en stor fordel.

Eksponentiel RCA, også kendt som Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), i eksponentiel RCA amplificerer en primer RCA-produktet, den anden primer hybridiserer med RCA-produktet og udvider sig, og erstatningen er allerede bundet til RCA-produktet. Nedstrømsprimerne forlænger strengen, og gentager forlængelse og erstatning for at producere et dendritisk produkt.

Fordelene og ulemperne ved nukleinsyreamplifikation med rullende cirkel

Fordele ved RCA:

Høj følsomhed, god specificitet og nem betjening.

Mangler ved RCA:

Baggrundsproblemer under signaldetektering.Under RCA-reaktionen kan den ucirkulerede hængelåsprobe og skabelon-DNA'et eller RNA'et fra den ubundne probe generere nogle baggrundssignaler. 

Nucleicacid-sekvens-baseret amplifikation

Nukleinsyresekvens-baseret amplifikation (NASBA) er en ny teknologi udviklet på basis af PCR.Det er en kontinuerlig og isotermisk nukleinsyreamplifikation styret af et par primere med en T7-promotorsekvens.Teknologien kan amplificere skabelon-RNA'et med omkring 109 gange på omkring 2 timer, hvilket er 1000 gange højere end den konventionelle PCR-metode og ikke kræver specielt udstyr.

Denne teknologi er blevet brugt til hurtig diagnosticering af sygdomme, så snart den dukkede op, og mange virksomheder bruger i øjeblikket denne metode i RNA-detektionssæt.

Selvom RNA-amplifikation også kan bruge revers transkription PCR-teknologi, har NASBA sine egne fordele: den kan udføres under relativt konstante temperaturforhold, og den er mere stabil og nøjagtig end traditionel PCR-teknologi.

Reaktionen er ved 41 grader Celsius og kræver AMV (avian myeloblastosis virus) revers transkriptase, RNase H, T7 RNA polymerase og et par primere for at fuldføre.

Processen omfatter hovedsageligt:

Den fremadrettede primer indeholder den komplementære sekvens af T7-promotoren.Under reaktionen binder den fremadrettede primer til RNA-strengen og katalyseres af AMV-enzymet til dannelse af en DNA-RNA-dobbeltstreng.

RNase H fordøjer RNA'et i den hybride dobbeltstreng og bevarer det enkeltstrengede DNA.

Under påvirkning af den omvendte primer og AMV-enzymet dannes en DNA-dobbeltstreng indeholdende T7-promotorsekvensen.

Under påvirkning af T7 RNA-polymerase fuldføres transkriptionsprocessen, og der produceres en stor mængde mål-RNA.

Fordele ved NASBA:

(1) Dens primer har en T7-promotorsekvens, men det fremmede dobbeltstrengede DNA har ingen T7-promotorsekvens og kan ikke amplificeres, så denne teknologi har høj specificitet og sensitivitet.

(2) NASBA inkorporerer direkte omvendt transkriptionsprocessen i amplifikationsreaktionen, hvilket forkorter reaktionstiden.

Ulemper ved NASBA:

(1) Reaktionskomponenterne er mere komplicerede.

(2) Tre slags enzymer er nødvendige for at gøre reaktionsomkostningerne højere.