Ct-værdi er den vigtigste resultatpræsentationsform for fluorescerende kvantitativ PCR.Det bruges til at beregne genekspressionsforskelle eller genkopinummer.Så hvad anses Ct-værdien af fluorescenskvantificering for rimelig?Hvordan sikrer man det effektive interval af Ct-værdi?
Hvad er Ct-værdi?
Under qPCR-amplifikationsprocessen, det tilsvarende antal amplifikationscyklusser (Cycle Threshold), når fluorescenssignalet fra det amplificerede produkt når den indstillede fluorescenstærskel.C står for Cycle og T står for Threshold.Kort sagt er Ct-værdien antallet af cyklusser, der svarer til, hvornår den indledende template-amplifikation når en vis mængde produkt i qPCR.Den såkaldte "en vis mængde produkt" vil blive yderligere forklaret senere.
Hvad gør Ct-værdien?
1.Sammenhæng mellem eksponentiel amplifikation, skabelonmængde og Ct-værdi
Ideelt set akkumuleres gener i qPCR ved eksponentiel amplifikation efter et vist antal cyklusser.Forholdet mellem antallet af amplifikationscyklusser og mængden af produkter er: Amplificeret produktmængde = initial skabelonmængde × (1+En) cyklustal.Imidlertid er qPCR-reaktionen ikke altid i en ideel situation.Når mængden af forstærket produkt når en "vis produktmængde", er antallet af cyklusser på dette tidspunkt Ct-værdien, og det er i den eksponentielle amplifikationsperiode.Forholdet mellem Ct-værdien og mængden af startskabelon: Der er en lineær sammenhæng mellem skabelonens Ct-værdi og logaritmen for skabelonens startkopinummer.Jo højere den oprindelige skabelonkoncentration er, jo mindre er Ct-værdien;jo lavere den oprindelige skabelonkoncentration er, jo større er Ct-værdien.
2. Amplifikationskurve, fluorescenstærskel og visse PCR-produktmængder
Mængden af qPCR-amplifikationsprodukt præsenteres direkte i form af fluorescerende signal, det vil sige amplifikationskurven.I det tidlige trin af PCR er amplifikationen under ideelle forhold, antallet af cyklusser er lille, produktakkumuleringen er lille, og niveauet af fluorescens kan ikke tydeligt skelnes fra fluorescensbaggrunden.Derefter øges fluorescensen og går ind i den eksponentielle fase.Mængden af PCR-produkt kan påvises på et bestemt tidspunkt, når PCR-reaktionen netop er i eksponentiel fase, hvilket kan bruges som "en vis mængde produkt", og det initiale indhold af skabelonen kan udledes heraf.Derfor er fluorescenssignalintensiteten svarende til en vis mængde produkt fluorescenstærsklen.
I det sene stadium af PCR viser amplifikationskurven ikke længere eksponentiel amplifikation og går ind i den lineære fase og plateaufasen.
3.Reproducerbarhed af Ct-værdier
Når PCR-cyklussen når cyklusnummeret for Ct-værdien, er den netop gået ind i den sande eksponentielle amplifikationsperiode.På nuværende tidspunkt er den lille fejl ikke blevet forstærket, så reproducerbarheden af Ct-værdien er fremragende, det vil sige, at den samme skabelon forstærkes på forskellige tidspunkter eller i forskellige rør på samme tid.Amplifikation, den opnåede Ct-værdi er konstant.
1.Forstærkningseffektivitet En
PCR-amplifikationseffektivitet refererer til den effektivitet, hvormed polymerasen omdanner genet, der skal amplificeres, til et amplikon.Amplifikationseffektiviteten, når et DNA-molekyle transformeres til to DNA-molekyler, er 100 %.Amplifikationseffektivitet udtrykkes almindeligvis som En.For at lette analysen af efterfølgende artikler introduceres kort de faktorer, der påvirker amplifikationseffektiviteten.
| Påvirkningsfaktorer | forklaring | Hvordan dømmer man? |
| A. PCR-hæmmere | 1. Template-DNA'et indeholder stoffer, der hæmmer PCR-reaktionen, såsom proteiner eller detergenter.2. cDNA'et efter revers transkription indeholder en høj koncentration af skabelon-RNA eller RT-reagenskomponenter, som også kan hæmme den efterfølgende PCR-reaktion. | 1. Om der er tale om forurening kan bedømmes ved at måle forholdet mellem A260/A280 og A260/A230 eller RNA-elektroforese.2. Om cDNA'et er fortyndet i henhold til et bestemt forhold efter revers transkription. |
| B. Forkert primerdesign | Primere udgløder ikke effektivt | Tjek primere for primer-dimere eller hårnåle, uoverensstemmelser og nogle gange spændende introniske designs. |
| C. Ukorrekt design af PCR-reaktionsprogram | 1. Primere kan ikke udgløde effektivt2. Utilstrækkelig frigivelse af DNA-polymerase 3. Langvarig højtemperatur DNA-polymeraseaktivitet faldt | 1. Udglødningstemperaturen er højere end TM-værdien af primeren2. Tiden før denaturering er for kort 3. Tiden for hvert trin i reaktionsproceduren er for lang |
| D. Utilstrækkelig blanding af reagenser eller pipetteringsfejl | I reaktionssystemet er den lokale koncentration af PCR-reaktionskomponenter for høj eller ujævn, hvilket resulterer i ikke-eksponentiel amplifikation af PCR-amplifikation | |
| E. Amplikonlængde | Længden af amplikonet er for lang, overstiger 300bp, og amplifikationseffektiviteten er lav | Tjek, at amplikonlængden er mellem 80-300bp |
| F. Indflydelse af qPCR-reagenser | Koncentrationen af DNA-polymerase i reagenset er lav, eller koncentrationen af ioner i bufferen er ikke optimeret, hvilket resulterer i, at Taq-enzymaktiviteten ikke når det maksimale | Bestemmelse af amplifikationseffektivitet ved standardkurve |
2.Omfang af Ct-værdier
Ct-værdier spænder fra 15-35.Hvis Ct-værdien er mindre end 15, anses det for, at amplifikationen er inden for intervallet af basislinjeperioden, og fluorescenstærsklen er ikke nået.Ideelt set er der et lineært forhold mellem Ct-værdien og logaritmen af skabelonens oprindelige kopinummer, det vil sige standardkurven.Gennem standardkurven, når amplifikationseffektiviteten er 100 %, er den beregnede Ct-værdi for kvantificering af genets enkeltkopital omkring 35. Hvis det er større end 35, er skabelonens initiale kopital teoretisk mindre end 1, hvilket kan betragtes som meningsløst.
For forskellige gen-Ct-områder er det på grund af forskellen i genkopiantal og amplifikationseffektivitet i den indledende skabelonmængde nødvendigt at lave en standardkurve for genet og beregne det lineære detektionsområde for genet.
3.Influencing faktorer af Ct værdi
Ud fra forholdet mellem antallet af amplifikationscyklusser og mængden af produkt: mængden af amplificeret produkt = mængden af initial template × (1+En) cyklusnummer, kan det ses, at under ideelle forhold vil mængden af initial template og En have en negativ indvirkning på Ct-værdien.Forskellen i skabelonkvalitet eller amplifikationseffektivitet vil få Ct-værdien til at være for stor eller for lille.
4.Ct-værdien er for stor eller for lille
Indlægstid: 22-2-2023
