Høretab (HL) er den mest almindelige sensoriske handicapsygdom hos mennesker.I udviklede lande er omkring 80% af tilfælde af prælingual døvhed hos børn forårsaget af genetiske faktorer.De mest almindelige er enkelt-gen-defekter (som vist i fig. 1), 124 genmutationer har vist sig at være forbundet med ikke-syndromisk høretab hos mennesker, resten er forårsaget af miljøfaktorer.Et cochleært implantat (en elektronisk enhed placeret i det indre øre, som giver elektrisk stimulation direkte til hørenerven) er langt den mest effektive mulighed for behandling af svær HL, mens et høreapparat (en ekstern elektronisk enhed, der konverterer og forstærker lydbølger) kan hjælpe patienter med moderat HL.Men der er i øjeblikket ingen lægemidler til rådighed til behandling af arvelig HL (GHL).I de senere år har genterapi fået stigende opmærksomhed som en lovende tilgang til behandling af dysfunktion i det indre øre.

Fig1.Fordeling af døvhedsassocieret variationstype.[1]

For nylig offentliggjorde forskere fra Salk Institute og University of Sheffield et forskningsresultat i Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], som viste brede anvendelsesmuligheder for in vivo genterapi af arvelig døvhed.Uri Manor, assisterende forskningsprofessor ved Salk Institute og direktør for Waitt Center for Advanced Biophotonics, sagde, at han blev født med alvorligt høretab og følte, at det ville være en vidunderlig gave at genoprette hørelsen.Hans tidligere forskning fandt, at Eps8 er et aktinregulerende protein med aktinbindings- og dækningsaktiviteter;i cochleære hårceller findes proteinkomplekset dannet af Eps8 med MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 og GNAI3 hovedsageligt i de fleste. Spidserne af lange stereocilier, som sammen med MYO15A lokaliserer BAIAP2L2 i spidserne af kortere stereocilier, er nødvendige til vedligeholdelse af hårbundter.Derfor kan Eps8 regulere længden af ​​hårcellernes stereocilier, hvilket er afgørende for normal hørefunktion;Eps8-sletning eller -mutation vil føre til korte stereocilier, som gør det ude af stand til korrekt at konvertere lyd til elektriske signaler til hjerneopfattelse, hvilket igen fører til døvhed..Samtidig fandt samarbejdspartner Walter Marcotti, professor ved University of Sheffield, ud af, at hårceller ikke kan udvikle sig normalt i fravær af Eps8.I denne undersøgelse gik Manor og Marcotti sammen for at undersøge, om tilføjelse af Eps8 til stereociliære celler kunne genoprette deres funktion og på sin side forbedre hørelsen hos mus.Forskerholdet brugte den adeno-associerede virus (AAV) vektor Anc80L65 til at levere den kodende sekvens indeholdende vildtype EPS8 ind i sneglen på Eps8-/- nyfødte P1-P2 mus ved hjælp af runde vinduesmembraner;i musecochleære hårceller Funktionen af ​​stereocilia blev repareret, før de modnede;og reparationseffekten var karakteriseret ved billedteknologi og måling af stereocilier.Resultaterne viste, at Eps8 øgede længden af ​​stereocilier og genoprettede hårcellefunktionen i lavfrekvente celler.De fandt også ud af, at cellerne over tid syntes at miste deres evne til at blive reddet af denne genterapi.Implikationen er, at denne behandling muligvis skal administreres in utero, da Eps8-/- hårceller kan have modnet eller akkumuleret skader, der ikke kan repareres, efter at musene blev født."Eps8 er et protein med mange forskellige funktioner, og der er stadig meget at udforske," sagde Manor.Fremtidig forskning vil omfatte at undersøge effekten af ​​Eps8-genterapi til at genoprette hørelsen på forskellige udviklingsstadier, og om det kan være muligt at forlænge behandlingsmulighederne.Tilfældigvis offentliggjorde professor KarenB Avraham fra Tel Aviv University i Israel i november 2020 sine resultater i tidsskriftet EMBO Molecular Medicine [3], ved hjælp af en innovativ genterapiteknologi til at skabe en harmløs syntetisk adeno-associeret virus AAV9-PHP.B, Genfejlen i hårcellerne fra Syne4-/- mus blev repareret ved at injicere en virus, der bærer den kodende sekvens for Syne4, ind i det indre øre hos mus, hvilket tillod det at trænge ind i hårcellerne og frigive det bårne genetiske materiale, hvilket tillod dem at modnes og fungere normalt (som i fig. 2).

Fig. 2.Skematisk repræsentation af det indre øres anatomi med fokus på Cortis organ og nesprin-4's cellulære funktion.

Det ses, at brugen af ​​genterapi til at opnå formålet med at behandle arvelige sygdomme på genniveau ved at indsætte, fjerne eller korrigere eventuelle muterede gener til behandling (det vil sige at kontrollere de genetiske ændringer i sygdommen) har en høj klinisk effekt.ansøgningsmuligheder.De nuværende genterapimetoder for genetisk defekt døvhed kan opdeles i følgende kategorier:

genudskiftning

Genudskiftning er uden tvivl den mest "ligetil" form for genterapi, baseret på at identificere og erstatte et defekt gen med en normal eller vildtype kopi af genet.Første vellykkede indre øre genterapi undersøgelse for høretab forårsaget af deletion af det vesikulære glutamat transporter 3 (VGLUT3) gen;AAV1-medieret levering af eksogen VGLUT3-overekspression i indre øre-hårceller (IHC'er) kan resultere i vedvarende genopretning af hørelsen, delvis genopretning af båndsynaptisk morfologi og konvulsive reaktioner [4].Men i eksemplerne, herunder de to AAV-leverede genudskiftninger beskrevet i introduktionen ovenfor, er det vigtigt at bemærke, at de musemodeller, der bruges til visse typer af arvelige høretabslidelser med gendeletion, er tidsmæssigt forskellige fra mennesker, og hos P1-mus er det indre øre i det modne udviklingsstadium.I modsætning hertil er mennesker født med et modent indre øre.Denne forskel forhindrer mulig anvendelse af museresultaterne til behandling af humane arvelige døvhedssygdomme, medmindre genterapi leveres til modne museører.

Genredigering: CRISPR/Cas9

Sammenlignet med "generstatning" har udviklingen af ​​genredigeringsteknologi bragt begyndelsen til behandling af genetiske sygdomme fra roden.Vigtigt er det, at genredigeringsmetoden afhjælper manglerne ved traditionelle overekspressionsgenterapimetoder, der ikke er egnede til dominerende arvelige døvesygdomme, og problemet med, at overekspressionsmetoden ikke varer længe.Efter at kinesiske forskere specifikt havde slået Myo6C442Y-mutantallelen ud i Myo6WT/C442Y-mus ved hjælp af AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2-genredigeringssystemet, og inden for 5 måneder efter knockouten, blev mus Den auditive funktion af modellen genoprettet;samtidig blev det også observeret, at overlevelsesraten for hårceller i det indre øre blev forbedret, formen af ​​cilia blev regelmæssig, og de elektrofysiologiske indikatorer blev korrigeret [5].Dette er det første studie i verden, der bruger CRISPR/Cas9-teknologi til behandling af arvelig døvhed forårsaget af Myo6-genmutation, og det er et vigtigt forskningsfremskridt inden for genredigeringsteknologi til behandling af arvelig døvhed.Den kliniske oversættelse af behandling giver et solidt videnskabeligt grundlag.

Genterapi leveringsmetoder

For at genterapi skal lykkes, kan nøgne DNA-molekyler ikke trænge effektivt ind i celler på grund af deres hydrofilicitet og negative ladning af fosfatgrupper, og for at sikre integriteten af ​​de supplerede nukleinsyremolekyler skal der vælges en sikker og effektiv metode.Det supplerede DNA afgives til målcellen eller vævet.AAV bruges i vid udstrækning som leveringsvehikel til sygdomsbehandling på grund af dets høje infektiøse effekt, lave immunogenicitet og brede tropisme til forskellige vævstyper.På nuværende tidspunkt har en stor mængde forskningsarbejde bestemt tropismen af ​​forskellige undertyper af AAV i forhold til forskellige celletyper i musesneglen.Brug af AAV-leveringskarakteristika kombineret med cellespecifikke promotorer kan opnå cellespecifik ekspression, hvilket kan reducere off-target-effekter.Derudover udvikles der som et alternativ til traditionelle AAV-vektorer konstant nye syntetiske AAV-vektorer, som viser overlegen transduktionsevne i det indre øre, hvoraf AAV2/Anc80L65 er den mest udbredte.Ikke-virale leveringsmetoder kan yderligere opdeles i fysiske metoder (mikroinjektion og elektroporation) og kemiske metoder (lipidbaserede, polymerbaserede og guldnanopartikler).Begge tilgange er blevet brugt i behandlingen af ​​arvelige døvhedssygdomme og har vist forskellige fordele og begrænsninger.Ud over leveringsvehikelen til genterapi som en vehikel kan forskellige fremgangsmåder til in vivo-genadministration anvendes baseret på forskellige målcelletyper, indgivelsesveje og terapeutisk effektivitet.Den indviklede struktur i det indre øre gør det vanskeligt at nå målceller, og fordelingen af ​​genomredigeringsmidler er langsom.Den membranøse labyrint er placeret i tindingeknoglens knoglelabyrint og inkluderer cochlearkanalen, halvcirkelformet kanal, utrikel og ballon.Dets relative isolation, minimale lymfecirkulation og adskillelse fra blodet ved hjælp af en blod-labyrint-barriere begrænser den effektive systemiske levering af terapeutika kun til neonatale mus.For at opnå virale titere, der er egnede til genterapi, er direkte lokal injektion af virale vektorer i det indre øre nødvendig.Etablerede injektionsveje omfatter [6]: (1) rund vinduesmembran (RWM), (2) trakeostomi, (3) endolymfatisk eller perilymfatisk cochleostomi, (4) rund vinduesmembran plus rørfenestration (CF) (som i fig. 3).

Fig. 3.Levering af det indre øre af genterapi.

Selvom der er gjort mange fremskridt inden for genterapi, baseret på kliniske translationelle mål, skal der arbejdes mere, før genterapi kan blive en førstelinjebehandlingsmulighed for patienter med genetiske sygdomme, især i udviklingen af ​​sikre og effektive vektorer og leveringsmetode.Men vi tror på, at disse typer behandlinger i den nærmeste fremtid vil blive en fast bestanddel af personlig terapi og vil have en enorm positiv indvirkning på livet for mennesker med genetiske lidelser og deres familier.

Foregene har også lanceret et high-throughput screeningskit for målrettede gener, som er hurtigt og kan udføre revers transkription og qPCR-reaktioner uden RNA-ekstraktion.

Produktlinks

Cell Direct RT-qPCR kit—Taqman/SYBR GREEN I

For mere produktinformation, kontakt venligst:

overseas@foregene.com