Direkte PCR er en reaktion, der direkte bruger dyre- eller plantevæv til amplifikation uden nukleinsyreekstraktion.På mange måder fungerer direkte PCR som almindelig PCR

Den største forskel er den brugerdefinerede buffer, der bruges i direkte PCR, prøven kan direkte udsættes for PCR-reaktionen uden nukleinsyreekstraktion, men der er tilsvarende krav til tolerancen af ​​enzymerne og foreneligheden af ​​bufferen involveret i den direkte PCR-reaktion.

Selvom der er mere eller mindre PCR-hæmmere i almindelige prøver, kan direkte PCR stadig opnå pålidelig amplifikation under påvirkning af enzymer og buffere.Den traditionelle PCR-reaktion kræver nukleinsyre af høj kvalitet som skabelon, hvilket kan hæmme den jævne udvikling af PCR-reaktionen, hvis skabelonen indeholder proteiner og andre urenheder.Direkte PCR er i øjeblikket en af ​​de mere populære teknologier inden for molekylær diagnostik.

01 Direkte PCR blev oprindeligt brugt til dyr og planter

Den tidligste anvendelse af direkte PCR er inden for dyr og planter, såsom blod, væv og hår fra rotter, katte, kyllinger, kaniner, får, kvæg osv., planteblade og frø osv., der bruges til at studere genotypebestemmelse, transgen, plasmiddetektion, gen-knockout-analyse, DNA-kildeidentifikation, artsanalyse og anden identifikation af arter og NP.

Disse felter har nogle fælles træk, det vil sige, at målgenindholdet er relativt højt og nukleinsyreekstraktion er besværlig, så direkte PCR kan ikke kun spare tid og have en lille indvirkning på resultaterne, men også spare omkostninger.

Direkte PCR brugt til patogendetektion er et spørgsmål om de seneste år, nogle PCR-reagensproducenter har gjort en stor indsats i denne retning, når de laver innovation.Især i denne COVID-19-epidemi er mange sådanne detektionsprodukter dukket op på markedet, såsom SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) undersøgt og udviklet af Foregene, som anvender Real-time RT PCR-teknologi (rRT-PCR) til kvalitativ påvisning af SARS-Co-harynge-2 prøver i nucleopharynge eller humane prøver. s.

Foregene er en af ​​de virksomheder, der bruger Direct PCR-teknologi til påvisning af normalt ORF1ab, N, E ogvariant afstamninger af nukleinsyrer i humane nasopharyngeale eller orofaryngeale podningsprøver, såsom SARS-CoV-2 B.1.1.7 linje (UK), B.1.351 linje (ZA), B.1.617 linje (IND) og P.1 linje (BR).

02  Reagenser nødvendige til direkte PCR

Prøv lysat

Prøvelysatet kan konfigureres af dig selv eller købes.Forskellen i sammensætningen af ​​forskellige mærker af lysat vil gøre lyseringsevnen anderledes, og så vil lyseringstiden være lidt anderledes.For eksempel, til klargøring af dyrevævsprøver, anbefales 30 minutters eller natten over lysering generelt, og lyseringsopløsningen til vira varierer fra 3-10 minutter.

PCR master mix

Det anbefales at bruge hot-start DNA-polymerase for at forbedre specifik amplifikation og øge amplifikationsevnen.Kernen i direkte PCR er en meget tolerant polymerase.

Eliminer eller inhiber komponenter i prøven, der påvirker DNA-amplifikation

Efter at prøven er behandlet med lysatet, vil proteiner, lipider og andre cellerester blive frigivet, disse stoffer vil hæmme PCR-reaktionen.Derfor kræver direkte PCR tilføjelse af tilsvarende fjernelse eller inhibitorer for at reducere indflydelsen af ​​disse faktorer.

03  En samling af fem videnspunkter om direkte PCR

For det første er Direct PCR-teknologi en direkte PCR-teknologi til forskellige biologiske prøver.Under denne tekniske tilstand er der ingen grund til at adskille og ekstrahere nukleinsyren, bruge vævsprøven direkte som objektet og tilføje målgenprimerne, der skal udføre PCR-reaktionen.

For det andet er Direct PCR-teknologi ikke kun en traditionel DNA-template-amplifikationsteknologi, men inkluderer også RNA-template revers transkription PCR.

For det tredje udfører Direct PCR-teknologi ikke kun rutinemæssige kvalitative PCR-reaktioner på vævsprøver, men inkluderer også Real-Time qPCR-reaktioner, som kræver, at reaktionssystemet har stærk anti-baggrundsfluorescensinterferensevne, og endogen fluorescens slukker den antagonistiske evne.

For det fjerde behøver prøverne, der er målrettet af Direct PCR-teknologien, kun frigivelse af nukleinsyreskabeloner og fjerner ikke proteiner, polysaccharider, saltioner osv., der forstyrrer PCR-reaktionen.Hvilket kræver, at nukleinsyrepolymerasen og PCR Mix i reaktionssystemet har fremragende resistens og tilpasningsevne for at sikre enzymaktivitet og replikationsnøjagtighed under komplekse forhold.

For det femte er vævsprøven målrettet af Direct PCR-teknologi uden nogen nukleinsyreberigelsesbehandling, og mængden af ​​skabelon er meget lille, hvilket kræver, at reaktionssystemet har ekstrem høj følsomhed og amplifikationseffektivitet.