Jeg tror, ​​at alle altid vil støde på sådanne eller sådanne problemer, når de laver PCR-reaktioner, men de fleste af dem kan klassificeres i to hovedproblemer:

For lidt amplifikation af genskabelonen (amplifikation);
For meget ikke-mål-genamplifikation.
Brug af tilsætningsstoffer er en af ​​de almindelige strategier til at løse disse problemer.Normalt har tilsætningsstoffers rolle to aspekter:
sekundær strukturaf gener (sekundær struktur);
Reducer uspecifik priming.
I dag vil redaktøren kort præsentere dig for de almindelige tilsætningsstoffer i PCR-reaktioner og deres funktioner.
Additiver, der reducerer sekundær struktur
sulfoxid(DMSO)
genprøvermed højt GC indhold.Imidlertid reducerer DMSO også i høj grad Taq-polymeraseaktivitet.Derfor skal alle balancere skabelontilgængeligheden og polymerasens aktivitet.Redaktøren foreslår, at du kan prøve forskellige koncentrationer af DSMO, såsom fra 2 % til 10 %, for at finde den koncentration, der passer til dit eksperiment.
Ikke-ioniske rengøringsmidler
Ikke-ioniske detergenter, såsom 0,1-1 % Triton X-100, Tween 20 eller NP-40, reducerer sædvanligvis DNA-sekundær struktur.Selvom dette kan øge amplifikationen af ​​template-genet, vil det også forårsage problemer med ikke-specifik amplifikation.Så disse tilsætningsstoffer fungerer godt til lavt udbytte PCR-reaktioner uden affald, men ikke så godt til relativt urene PRC-reaktioner.En anden fordel ved ikke-ioniske detergenter er reduktionen af ​​SDS-kontamination.Normalt under DNA-ekstraktionsprocessen vil SDS blive bragt til PCR-trinnet, som i høj grad hæmmer aktiviteten af ​​polymerasen.Derfor kan tilsætning af 0,5% Tween-20 eller Tween-40 til reaktionen neutralisere de negative virkninger af SDS.
Betain_
Betain kan forbedre DNA-amplifikation ved at reducere sekundær strukturdannelse og er generelt en "mysterie" tilføjelse til kommercielle PCR-kits.Hvis du ønsker at bruge betain, skal du sætte betain eller betain mono-hydrat (Betain eller Betaine mono-hydrat), men ikke betain hydrochlorid (Betain HCl), juster til en slutkoncentration på 1-1,7M.Betain kan også hjælpe med at forbedre specificiteten, fordi det eliminerer afhængigheden af ​​baseparsammensætningen af ​​DNA-smeltning/DNA-denaturering.
Tilsætningsstoffer for at reducere uspecifik priming
Formamid
Formamid er et almindeligt anvendt organisk PCR-additiv.Den kan kombineres med større rille og mindre rille i DNA, og derved reducere stabiliteten af ​​master-DNA-dobbelthelixen og sænke DNA'ets smeltetemperatur.Koncentrationen af ​​formamid anvendt i PCR-forsøg er sædvanligvis 1%-5%.
Tetramethylammoniumchlorid( TMAC)
Tetramethylammoniumchlorid kan øge specificiteten af ​​hybridisering (hybridiseringsspecificitet) og øge smeltetemperaturen af ​​DNA.Således kan TMAC fjerne uspecifik priming og reducere fejlbinding af DNA og RNA.Hvis du brugerdegenererede primerei PCR-reaktionen skal du huske at tilføje TMAC, som almindeligvis anvendes i en koncentration på 15-100mM.
Andre almindelige tilsætningsstoffer
Ud over de to ovennævnte kategorier af additiver er der mange almindelige additiver i PCR-reaktioner, selvom de har forskellige funktioner, er de også meget vigtige.
Magnesium ion
Magnesiumion er en uundværlig cofaktor (cofaktor) af polymerase, det vil sige uden magnesiumion er polymerase inaktiv.Imidlertid kan for mange magnesiumioner også påvirke effektiviteten af ​​polymerasen.Koncentrationen af ​​magnesiumioner i hver PCR-reaktion vil variere.Chelaterende midler (såsom EDTA eller citrat), koncentrationen af ​​dNTP'er og proteiner påvirker alle koncentrationen af ​​magnesiumioner.Så hvis du har problemer med dit PCR-eksperiment, kan du prøve at ændre forskellige magnesiumionkoncentrationer, for eksempel fra 1,0 til 4,0mM, med et interval på 0,5-1mM imellem.
Det er værd at bemærke, at flere fryse-tø-cyklusser kan føre til koncentrationsstratificering af magnesiumchloridopløsningen.Derfor skal du opløse det helt inden hver brug, og blande det godt inden du bruger det.
Bovint serumalbumin(Bovint albumin, BSA)
I molekylærkemiforsøg er bovint serumalbumin et meget almindeligt tilsætningsstof, især i restriktionsenzymfordøjelse og PCR-forsøg.I PCR-reaktioner er BSA nyttig til at reducere forurenende stoffer såsom phenolforbindelser.Og det siges også, at det kan reducere reaktanters adhæsion til reagensglasvæggen.I PCR-reaktionen kan koncentrationen af ​​tilsat BSA normalt nå 0,8 mg/ml.
 
Relaterede produkter:
PCR Hero(med farvestof)
PCR Hero