I den tidlige fase af udbruddet, på grund af den hurtige udvikling, er hurtig diagnosticering af mistænkte patienter nøglen til at forebygge COVID-19.Nogle godkendte nukleinsyredetektionsreagenser har en kort udviklingstid, og der er problemer som forhastet præstationsbekræftelse, utilstrækkelig reagensoptimering og store forskelle mellem batches;Problemerne i forskellige kliniske laboratorier i forskellige aspekter af nukleinsyredetektionsprocessen kan også påvirke nøjagtigheden af ​​nukleinsyredetektionsresultater.Denne artikel vil fokusere på de vigtigste links og punkter i den nuværende SARS-CoV-2-nukleinsyredetektion og analysere problemerne med falsk negativ og positiv genundersøgelse af laboratorie-nukleinsyredetektion og klinisk inkonsistens.

Principper for SARS-CoV-2-nukleinsyredetektion

SARS-CoV-2 er et RNA-virus med en genomsekvens på omkring 29 kb, med 10 gener, som effektivt kan kode for 10 proteiner.Vira er sammensat af RNA og protein, og det yderste lag er en ydre belægning bestående af lipider og glykoproteiner.Indeni pakker proteinkapsiden RNA'et ind og beskytter derved det let nedbrydelige RNA (P1).

P1 Struktur af SARS-COV-2

Vira invaderer celler gennem specifikke celleoverfladereceptorer for at forårsage infektion og bruger værtsceller til at replikere.

Princippet for viral nukleinsyredetektion er at eksponere det virale RNA gennem et cellelysat og derefter bruge real-time fluorescerende omvendt transkription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR) til påvisning.

Nøglen til detektionsprincippet er at bruge primere og prober til at opnå "målrettet matchning" af nukleinsyresekvenser, det vil sige at finde nukleinsyresekvensen af ​​SARS-CoV-2, der er forskellig fra andre vira i omkring 30.000 baser (ligheden mellem nukleinsyre og andre vira) "Lav" område), design primere og prober.

Primerne og proberne er meget matchede med den specifikke region af SARS-CoV-2-nukleinsyre, det vil sige, at specificiteten er meget stærk.Når det fluorescerende RT-PCR-amplifikationsresultat i realtid af prøven, der skal testes, er positivt, beviser det, at SARS-CoV-2 er til stede i prøven.Se P2.

P2-trin til SARS-CoV-2-nukleinsyrebestemmelse (real-time fluorescerende RT-PCR)

Betingelser og krav til laboratoriet for SARS-CoV-2-nukleinsyredetektion

Nukleinsyretestlaboratorier er de mest ideelle til miljøer med negativt tryk, og de bør være opmærksomme på trykovervågning, holde luftstrømmen og eliminere aerosoler.Nukleinsyretestpersonale skal have tilsvarende kvalifikationer, modtage relevant uddannelse i polymerasekædereaktion og bestå bedømmelsen.Laboratoriet bør være strengt styret, zoneinddelt på plads, og irrelevant personale er strengt forbudt at komme ind.Det rene område skal ventileres og desinficeres på plads.Relevante genstande placeres i zoner, rene og snavsede adskilles, udskiftes til tiden og dekontamineres på plads.Rutinemæssig desinfektion: Klorholdigt desinfektionsmiddel er hovedløsningen til større områder, og 75 % alkohol kan bruges til små områder.En god måde at håndtere aerosoler på er at åbne vinduer for ventilation, og luftdesinfektion kan også udføres ved hjælp af ultraviolette stråler, filtrering og luftdesinfektion.

Nøglelinks og parametre for SARS-CoV-2-nukleinsyrebestemmelse (real-time fluorescerende RT-PCR)

Selvom laboratorier generelt er meget opmærksomme på nukleinsyre-"detektion", er nukleinsyre-"ekstraktion" faktisk også et af nøgletrinene for vellykket påvisning, som er tæt forbundet med indsamling og opbevaring af virusprøver.

På nuværende tidspunkt bruger de mest udbredte respiratoriske prøver, såsom nasopharyngeale podninger, den anden metode, som er en inaktiverings- (konserverings-) opløsning fremstillet baseret på nukleinsyreekstraktion og lysis-opløsning.På den ene side kan denne viruskonserveringsopløsning denaturere virusets protein, miste sin aktivitet og ikke længere være smitsom og forbedre sikkerheden på transport- og detektionsstadiet;på den anden side kan den direkte knække virussen for at frigive nukleinsyren, eliminere det nukleinsyrenedbrydende enzym og forhindre virussen.RNA'et nedbrydes.

En virusprøveopløsning fremstillet på basis af nukleinsyreekstraktionslyseopløsning.Hovedkomponenterne er afbalancerede salte, ethylendiamintetraeddikesyre-chelateringsmiddel, guanidinsalt (guanidinisothiocyanat, guanidinhydrochlorid osv.), anionisk overfladeaktivt stof (dodecan) Natriumsulfat), kationisk overfladeaktivt middel (tetradecyltrimethylammoniumoxalat), phenothenolin og flere andre proteinkomponenter, K-hydroxy- og hydroxy-protein, 8-hydroxinol, K.På nuværende tidspunkt er der mange typer af nukleinsyreekstraktionssæt, og der anvendes forskellige nukleinsyreekstraktions- og oprensningsreagenser.Selv hvis det samme nukleinsyreekstraktions- og oprensningsreagens anvendes, er ekstraktionsprocedurerne for hvert sæt forskellige.

På nuværende tidspunkt er de nukleinsyredetektionsprodukter, der er godkendt af National Medical Products Administration, udvalgt baseret på ORF1ab-, E- og N-generne i SARS-CoV-2-genomet.Detektionsprincipperne for forskellige produkter er grundlæggende de samme, men deres primere og probedesign er forskellige.Der er single-target segmenter (ORF1ab), dual-target segmenter (ORF1ab, N eller E) og tre-target segmenter (ORF1ab, N og E).Forskellen mellem detektion og fortolkning, nukleinsyreekstraktion og fluorescerende RT-PCR-reaktionssystem i realtid bør henvise til de relevante kitinstruktioner, og det anbefales, at brugerne nøje følger den fortolkningsmetode, der er specificeret i kitvejledningen til fortolkning.De fælles regioner, primere og probesekvenser amplificeret ved real-time fluorescerende RT-PCR er vist i P3.

P3 Placeringen af ​​SARS-CoV-2 amplikonmålet på genomet og sekvensen af ​​primere og prober

Fortolkning af resultaterne af SARS-CoV-2-nukleinsyrebestemmelse (Real-Time fluorescerende RT-PCR)

"Pneumoni-forebyggelses- og kontrolplan for SARS-CoV-2-infektion (anden udgave)" præciserede for første gang kriterierne for at bedømme resultaterne af enkelt gen-amplifikation:

1. Ingen Ct eller Ct≥40 er negativ;

2. Ct<37 er positiv;

3. Ct-værdien på 37-40 er gråskalaområdet.Det anbefales at gentage forsøget.Hvis resultatet af gentagelse af Ct<40 og amplifikationskurven har tydelige toppe, bedømmes prøven som positiv, ellers er den negativ."

Den tredje udgave af guiden og den fjerde udgave af guiden videreførte ovenstående kriterier.På grund af de forskellige mål, der anvendes i kommercielle kits, gav den førnævnte 3. udgave af vejledningen imidlertid ikke kriterierne for bestemmelse af kombinationen af ​​mål, hvilket understreger, at instruktionerne fra producenten skal have forrang.Fra og med den femte udgave af retningslinjerne er to mål blevet præciseret, især vurderingskriterierne for et enkelt mål, der er vanskeligt at bedømme.Det vil sige, at hvis laboratoriet ønsker at bekræfte, at et tilfælde er positivt for SARS-CoV-2-nukleinsyrepåvisning, skal følgende være opfyldt 1 af 2 betingelser:

(1) To mål for SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) i samme prøve testes positive ved real-time fluorescerende RT-PCR.Hvis et enkelt mål er positivt, kræves genudtagning og gentestning.Hvis testresultaterne er Hvis det enkelte mål stadig er positivt, vurderes det som positivt.

(2) To prøver af real-time fluorescerende RT-PCR viste et enkelt mål positivt på samme tid, eller to prøver af samme type viste et enkelt mål positivt testresultat, som kan bedømmes som positivt.Retningslinjerne understreger dog også, at de negative resultater af nukleinsyretestning ikke kan udelukke SARS-CoV-2-infektion.Faktorer, der kan forårsage falske negativer, skal udelukkes, herunder dårlig prøvekvalitet (respiratoriske prøver fra oropharynx og andre dele), prøvetagning for tidligt eller for sent, prøver blev ikke opbevaret, transporteret og behandlet korrekt, og selve teknologien havde problemer (virusvariation, PCR-hæmning) osv.

Årsager til falske negativer i SARS-CoV-2-detektionen

Begrebet "falsk negativ" i nukleinsyretest, der i øjeblikket er berørt, refererer ofte til "falske negativer", hvor nukleinsyretestresultaterne er inkonsistente med kliniske manifestationer, det vil sige, at kliniske symptomer og billeddiagnostiske resultater er stærkt mistænkte for COVID-19, men nukleinsyretests er altid "negative" mange gange.Det kliniske laboratoriecenter under National Health Commission forklarede den "falsk negative" SARS-CoV-2-test.

(1) Der er en vis mængde virus i cellerne hos den inficerede person.Eksisterende data viser, at efter at kroppen er inficeret med virussen, kommer virussen ind i halsen gennem næse og mund, derefter til luftrøret og bronkierne og når derefter alveolerne.Den inficerede person vil opleve inkubationsperioden, milde symptomer og derefter processen med alvorlige symptomer og forskellige stadier af sygdommen.Og mængden af ​​virus til stede i forskellige dele af kroppen er forskellig.

Med hensyn til den virale belastning af celletyper, alveolære epitelceller (nedre luftveje)> luftvejsepitelceller (øvre luftveje)> fibroblaster, endotelceller og makrofager osv.;fra prøvetypen, alveolær skyllevæske (den mest fremragende)>dybt hostende sputum>nasopharyngeal podning>oropharyngeal podning>blod.Derudover kan virussen også påvises i afføring.Men i betragtning af bekvemmeligheden ved operation og accept af patienter, er den almindeligt anvendte kliniske prøverækkefølge orofaryngeal podning>nasopharyngeal podning>bronkial skyllevæske (kompleks operation) og dyb opspyt (normalt tør hoste, svær at få).

Derfor er mængden af ​​virus i cellerne i oropharynx eller nasopharynx hos nogle patienter lille eller ekstremt lav.Hvis der kun tages prøver af oropharynx eller nasopharynx til test, vil den virale nukleinsyre ikke blive påvist.

(2) Ingen virusholdige celler blev opsamlet under prøvetagning, eller viral nukleinsyre blev ikke effektivt konserveret.

[① Forkert indsamlingssted, for eksempel ved indsamling af orofaryngeale podninger, er indsamlingsdybden ikke nok, de indsamlede nasopharyngeale podninger opsamles ikke dybt i næsehulen osv. De fleste af de indsamlede celler kan være virusfrie celler;

②Sampleprøver bruges forkert.For eksempel anbefales syntetiske fibre som PE-fiber, polyesterfiber og polypropylenfiber til podehovedets materiale.Naturlige fibre såsom bomuld bruges i den faktiske drift (stærk adsorption af protein og ikke let at vaske ud) Og nylonfibre (dårlig vandabsorption, hvilket fører til utilstrækkelig prøveudtagningsvolumen);

③Forkert brug af virusopbevaringsrør, såsom misbrug af polypropylen- eller polyethylenplastopbevaringsrør, der er lette at absorbere nukleinsyrer (DNA/RNA), hvilket resulterer i et fald i koncentrationen af ​​nukleinsyre i opbevaringsopløsningen.I praksis anbefales det at bruge polyethylen-propylen-polymerplast og nogle specialbehandlede polypropylen-plastikbeholdere til opbevaring af virale nukleinsyrer.]

[① Forkert indsamlingssted, for eksempel ved indsamling af orofaryngeale podninger, er indsamlingsdybden ikke nok, de indsamlede nasopharyngeale podninger opsamles ikke dybt i næsehulen osv. De fleste af de indsamlede celler kan være virusfrie celler;

②Sampleprøver bruges forkert.For eksempel anbefales syntetiske fibre som PE-fiber, polyesterfiber og polypropylenfiber til podehovedets materiale.Naturlige fibre såsom bomuld bruges i den faktiske drift (stærk adsorption af protein og ikke let at vaske ud) Og nylonfibre (dårlig vandabsorption, hvilket fører til utilstrækkelig prøveudtagningsvolumen);

③Forkert brug af virusopbevaringsrør, såsom misbrug af polypropylen- eller polyethylenplastopbevaringsrør, der er lette at absorbere nukleinsyrer (DNA/RNA), hvilket resulterer i et fald i koncentrationen af ​​nukleinsyre i opbevaringsopløsningen.I praksis anbefales det at bruge polyethylen-propylen-polymerplast og nogle specialbehandlede polypropylen-plastikbeholdere til opbevaring af virale nukleinsyrer.]

(4) Den kliniske laboratoriedrift er ikke standardiseret.Prøvetransport og opbevaringsforhold, standardiseret drift af kliniske laboratorier, resultatfortolkning og kvalitetskontrol er nøglefaktorerne for at sikre nøjagtigheden og pålideligheden af ​​testresultater.Ifølge resultaterne af den eksterne kvalitetsevaluering udført af det kliniske laboratoriecenter i National Health Commission den 16.-24. marts 2020 af de 844 laboratorier, der modtog gyldige resultater, var 701 (83,1%) kvalificerede, og 143 (16,9%) var ikke kvalificerede.Kvalificeret, de overordnede laboratorietestbetingelser er gode, men forskellige laboratorier har stadig forskelle i personaledriftsevne, single-target positiv prøvefortolkningsevne og kvalitetskontrol.

Hvordan reducerer man det falske negative ved SARS-CoV-2-nukleinsyrepåvisning?

Reduktion af falske negativer i nukleinsyredetektion bør optimeres ud fra de fire aspekter af produktion af falske negativer.

(1) Der er en vis mængde virus i cellerne hos den inficerede person.Koncentrationen af ​​virussen i forskellige dele af kroppen hos formodede inficerede personer vil være forskellig på forskellige tidspunkter.Hvis der ikke er svælg, kan det være i bronkial lavagevæske eller afføring.Hvis flere typer prøver kan indsamles på samme tid eller på forskellige stadier af sygdomsprogression til testning, vil det hjælpe med at undgå falske negativer.

(2) Celler indeholdende virus bør indsamles under prøvetagning.Dette problem kan i vid udstrækning løses ved at styrke uddannelsen af ​​prøvesamlere.

(3) Pålidelige IVD-reagenser.Ved at udføre forskning i evaluering af reagensernes påvisningsevne på nationalt plan og diskutere de eksisterende problemer, kan reagensernes påvisningseffektivitet forbedres yderligere, og analysens følsomhed kan forbedres.

(4) Standardiseret drift af kliniske laboratorier.Ved at styrke uddannelsen af ​​laboratoriepersonale, løbende forbedre laboratoriekvalitetsstyringssystemet, sikre rimelige opdelinger og forbedre personalets evne til at opdage, er det muligt at reducere falske negativer på grund af ukorrekt laboratoriedrift.

Årsager til re-test positiv af SARS-CoV-2 nukleinsyretest hos raske og udskrevne patienter

"COVID-19 Diagnosis and Treatment Plan (Trial Seventh Edition)" fastslår klart, at et af kriterierne for, at COVID-19 patienter kan helbredes og udskrives fra hospitalet er, at to på hinanden følgende luftvejsprøver har en negativ nukleinsyretest (mindst 24 timers mellemrum), men der er meget få SARS-CoV-2-patienter, der igen var positive i forskellige nukleinsyre-udledningspatienter.

(1)SARS-CoV-2 er en ny virus.Det er nødvendigt yderligere at forstå dens patogene mekanisme, det fulde billede af den forårsagede sygdom og sygdomsforløbets karakteristika.Derfor er det på den ene side nødvendigt at styrke håndteringen af ​​udskrevne patienter og gennemføre 14 dages medicinsk observation.Foretage opfølgning, helbredsovervågning og sundhedsvejledning for at uddybe forståelsen af ​​hele processen med sygdommens forekomst, udvikling og udfald.

(2) Patienten kan blive inficeret med virussen igen.Akademiker Zhong Nanshan sagde: Fordi helbredte patienter har antistoffer, kan SARS-CoV-2 elimineres af antistoffer, når de invaderer igen.Der er mange årsager, som kan være årsagen til den helbredte patient, eller det kan være relateret til mutationen af ​​virussen eller endda årsagen til laboratorieundersøgelser.Hvis det er selve virussen, kan SARS-CoV-2-mutationen forårsage, at antistoffet produceret af den restituerede patient er ineffektivt mod det muterede virus.Hvis patienten er inficeret med den muterede virus igen, kan nukleinsyretesten være positiv igen.

(3) For så vidt angår laboratorietestmetoder, har hver testmetode sine begrænsninger.SARS-CoV-2-nukleinsyrepåvisning skyldes valget af gensekvens, sammensætningen af ​​reagenser, følsomheden af ​​metoden og andre årsager, hvilket fører til, at de eksisterende kits har deres egne nedre detektionsgrænser.Efter at patienten er behandlet, falder virussen i kroppen.Når virusbelastningen i prøven, der skal testes, er under den nedre detektionsgrænse, vises et "negativt" resultat.Dette resultat betyder dog ikke, at virussen i kroppen er helt forsvundet.Virussen kan være efter behandlingen er stoppet.Resurgence”, fortsæt med at kopiere.Derfor anbefales det at gennemgå en gang om ugen inden for 2 til 4 uger efter udskrivelsen.

(4) Nukleinsyre er virusets genetiske materiale.Virusset dræbes, efter at patienten har gennemgået antiviral behandling, men de resterende virale RNA-fragmenter tilbageholdes stadig i menneskekroppen og udledes ikke fuldstændigt fra kroppen.Nogle gange kan det under visse omstændigheder bevares mere.Lang tid, og på dette tidspunkt vil nukleinsyretesten være "forbigående" positiv.Med forlængelse af patientens restitutionstid, efter at de resterende RNA-fragmenter i kroppen gradvist er opbrugt, kan nukleinsyretestresultatet blive negativt.

(5) Nukleinsyretestresultatet af SARS-CoV-2 beviser kun tilstedeværelsen eller fraværet af viralt RNA og kan ikke bevise virussens aktivitet og om virussen er overførbar.Det er nødvendigt at bevise, om en patient, der har en positiv nukleinsyretest igen, vil blive en smittekilde igen.Det er nødvendigt at udføre viruskultur på kliniske prøver og dyrke en "levende" virus for at bevise, at den er infektiøs.

Resumé

Sammenfattende kan SARS-CoV-2-nukleinsyretest falsk negativ, gentest positiv og andre tilstande, der er uforenelige med kliniske manifestationer, ikke helt undgås.Ved egentlig screening og testning anbefales det at kombinere kliniske symptomer, billeddiagnostiske undersøgelser (CT) og eksperimenter Laboratorietest (nukleinsyretest + virusspecifik antistoftest) resultater for omfattende diagnose for at forhindre manglende diagnose og fejldiagnosticering.Hvis testresultaterne viser sig at være åbenlyst inkonsistente med de kliniske manifestationer, anbefales det at foretage en omfattende analyse af hele testforbindelsen (prøveindsamling, cirkulation og behandlingslinks) for at udelukke SARS-CoV-2 virus tidlig infektion, tilbagevendende infektion eller kombineret med andre luftvejsvirusinfektioner osv. muligt.Hvis forholdene tillader det, anbefales det at indsamle mere følsomme prøver såsom sputum eller alveolær skyllevæske til genundersøgelse.

Relaterede produkter:

SARS-CoV-2 nukleinsyredetektionskit (multiplex PCR fluorescerende probemetode)