• PCR er en metode, der bruges til at amplificere DNA fra en lille mængde DNA-skabelon.RT-PCR bruger revers transkription til at producere en DNA-skabelon fra en RNA-kilde, som derefter kan amplificeres.
• PCR og RT-PCR er typisk endepunktsreaktioner, mens qPCR og RT-qPCR bruger kinetikken for produktsyntesehastigheden under PCR-reaktionen til at kvantificere mængden af ​​tilstedeværende skabelon.
• Nyere metoder, såsom digital PCR, giver absolut kvantificering af den oprindelige DNA-skabelon, mens metoder såsom isotermisk PCR reducerer behovet for dyrt udstyr for at give pålidelige resultater.

Polymerasekædereaktion (PCR) er en relativt simpel og meget brugt molekylærbiologisk teknik til at amplificere og detektere DNA- og RNA-sekvenser.Sammenlignet med traditionelle metoder til DNA-kloning og amplifikation, som ofte kan tage dage, kræver PCR kun et par timer.PCR er meget følsom og kræver minimal skabelon til påvisning og amplifikation af specifikke sekvenser.Grundlæggende PCR-metoder har udviklet sig yderligere fra simpel DNA- og RNA-detektion.Nedenfor har vi givet et overblik over de forskellige PCR-metoder og de reagenser, vi leverer hos Enzo Life Sciences til dine forskningsbehov.Vi sigter mod at hjælpe forskere med hurtigt at få adgang til PCR-reagenser til brug i deres næste forskningsprojekt!

PCR

Til standard PCR er alt hvad du behøver en DNA-polymerase, magnesium, nukleotider, primere, DNA-skabelonen, der skal amplificeres, og en termocykler.PCR-mekanismen er lige så enkel som dens formål: 1) dobbeltstrenget DNA (dsDNA) er varmedenatureret, 2) primere tilpasser sig de enkelte DNA-strenge, og 3) primerne forlænges med DNA-polymerase, hvilket resulterer i to kopier af original DNA-streng.Denaturerings-, annealing- og forlængelsesprocessen over en række temperaturer og tider er kendt som én amplifikationscyklus (fig. 1).

Hvert trin i cyklussen skal optimeres til det anvendte skabelon og primersæt.Denne cyklus gentages ca. 20-40 gange, og det amplificerede produkt kan derefter analyseres, typisk med agarosegel (fig. 2).

Da PCR er en meget følsom metode, og der kræves meget små volumener til enkeltreaktioner, anbefales det at forberede en mastermix til flere reaktioner.Masterblandingen skal blandes godt og derefter opdeles efter antallet af reaktioner, hvilket sikrer, at hver reaktion vil indeholde den samme mængde enzym, dNTP'er og primere.Mange leverandører, såsom Enzo Life Sciences, tilbyder også PCR-blandinger, der allerede indeholder alt undtagen primere og DNA-skabelonen.

Guanin/Cytosin-rige (GC-rige) regioner repræsenterer en udfordring i standard PCR-teknikker.GC-rige sekvenser er mere stabile end sekvenser med lavere GC-indhold.Ydermere har GC-rige sekvenser en tendens til at danne sekundære strukturer, såsom hårnålesløjfer.Som et resultat er GC-rige dobbeltstrenge vanskelige at adskille fuldstændigt under denatureringsfasen.Følgelig kan DNA-polymerase ikke syntetisere den nye streng uden hindring.En højere denatureringstemperatur kan forbedre dette, og justeringer mod en højere annealingstemperatur og kortere annealingstid kan forhindre den uspecifikke binding af GC-rige primere.Yderligere reagenser kan forbedre amplifikationen af ​​GC-rige sekvenser.DMSO, glycerol og betain hjælper med at forstyrre de sekundære strukturer, der er forårsaget af GC-interaktioner, og derved lette adskillelsen af ​​dobbeltstrengene.

Hot Start PCR

Uspecifik amplifikation er et problem, der kan opstå under PCR.De fleste DNA-polymeraser, der bruges til PCR, fungerer bedst ved temperaturer omkring 68°C til 72°C.Enzymet kan dog også være aktivt ved lavere temperaturer, dog i lavere grad.Ved temperaturer langt under annealingstemperaturen kan primere binde uspecifikt og føre til uspecifik amplifikation, selvom reaktionen er sat op på is.Dette kan forhindres ved at bruge polymerasehæmmere, der kun dissocierer fra DNA-polymerasen, når en vis temperatur er nået, deraf betegnelsen hotstart PCR.Inhibitoren kan være et antistof, der binder polymerasen og denaturerer ved den initiale denatureringstemperatur (typisk 95°C).

High Fidelity Polymerase

Mens DNA-polymeraser amplificerer ret præcist til den oprindelige skabelonsekvens, kan der forekomme fejl i nukleotidmatchning.Fejlparringer i applikationer såsom kloning kan resultere i trunkerede transkripter og fejltranslaterede eller inaktive proteiner nedstrøms.For at undgå disse uoverensstemmelser er polymeraser med en "korrekturlæsning"-aktivitet blevet identificeret og indarbejdet i arbejdsgangen.Den første korrekturlæsende polymerase, Pfu, blev identificeret i 1991 i Pyrococcus furiosus.Dette Pfu-enzym har en 3' til 5' exonukleaseaktivitet.Efterhånden som DNA'et amplificeres, fjerner exonukleasen mismatchede nukleotider i 3'-enden af ​​strengen.Det korrekte nukleotid udskiftes derefter, og DNA-syntesen fortsætter.Identifikationen af ​​forkerte nukleotidsekvenser er baseret på bindingsaffiniteten for det korrekte nukleosidtrifosfat med enzymet, hvor ineffektiv binding bremser syntesen og muliggør den korrekte erstatning.Korrekturlæsningsaktiviteten af ​​Pfu-polymerase resulterer i færre fejl i den endelige sekvens sammenlignet med Taq DNA-polymerase.I de senere år er andre korrekturlæsningsenzymer blevet identificeret, og der er foretaget modifikationer af det originale Pfu-enzym for yderligere at reducere fejlraten under DNA-amplifikation.

RT-PCR

Revers transkriptions-PCR eller RT-PCR tillader brugen af ​​RNA som skabelon.Et yderligere trin tillader påvisning og amplifikation af RNA.RNA'et transskriberes omvendt til komplementært DNA (cDNA) ved anvendelse af revers transkriptase.Kvaliteten og renheden af ​​RNA-skabelonen er afgørende for succesen af ​​RT-PCR.Det første trin i RT-PCR er syntesen af ​​en DNA/RNA-hybrid.Revers transkriptase har også en RNase H-funktion, som nedbryder RNA-delen af ​​hybriden.Det enkeltstrengede DNA-molekyle fuldendes derefter af den DNA-afhængige DNA-polymeraseaktivitet af revers transkriptase til cDNA.Effektiviteten af ​​førstestrengsreaktionen kan påvirke amplifikationsprocessen.Herfra anvendes standard PCR-proceduren til at amplificere cDNA'et.Muligheden for at vende RNA til cDNA ved RT-PCR har mange fordele, og den bruges primært til genekspressionsanalyse.RNA er enkeltstrenget og meget ustabilt, hvilket gør det udfordrende at arbejde med.Det fungerer almindeligvis som et første trin i qPCR, som kvantificerer RNA-transkripter i en biologisk prøve.

qPCR og RT-qPCR

Kvantitativ PCR (qPCR) bruges til at detektere, karakterisere og kvantificere nukleinsyrer til adskillige anvendelser.I RT-qPCR kvantificeres RNA-transkripter ofte ved at omvendt transskribere dem til cDNA først, som beskrevet ovenfor, og derefter udføres qPCR efterfølgende.Som i standard PCR amplificeres DNA ved tre gentagne trin: denaturering, annealing og forlængelse.I qPCR muliggør fluorescerende mærkning imidlertid indsamling af data, efterhånden som PCR skrider frem.Denne teknik har mange fordele på grund af de tilgængelige metoder og kemier.

I farvestofbaseret qPCR (typisk grøn) tillader fluorescerende mærkning kvantificering af de amplificerede DNA-molekyler ved at anvende et dsDNA-bindende farvestof.Under hver cyklus måles fluorescensen.Fluorescenssignalet stiger proportionalt med mængden af ​​replikeret DNA.Derfor kvantificeres DNA'et i "realtid" (fig. 3).Ulemperne ved farvestofbaseret qPCR er, at kun ét mål kan undersøges ad gangen, og at farvestoffet vil binde til ethvert ds-DNA, der er til stede i prøven.

I probe-baseret qPCR kan mange mål påvises samtidigt i hver prøve, men dette kræver optimering og design af en eller flere målspecifikke probe(r), der anvendes ud over primere.Flere typer probedesigns er tilgængelige, men den mest almindelige type er en hydrolyseprobe, som inkorporerer en fluorofor og quencher.Fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) forhindrer emission af fluoroforen via quencheren, mens sonden er intakt.Under PCR-reaktionen hydrolyseres proben imidlertid under primerforlængelse og amplifikation af den specifikke sekvens, den er bundet til.Spaltningen af ​​proben adskiller fluoroforen fra quencheren og resulterer i en amplifikationsafhængig stigning i fluorescens (fig. 4).Fluorescenssignalet fra en probebaseret qPCR-reaktion er således proportional med mængden af ​​probemålsekvensen, der er til stede i prøven.Fordi probebaseret qPCR er mere specifik end farvestofbaseret qPCR, er det ofte den teknologi, der bruges i qPCR-baserede diagnostiske assays.

Isoterm forstærkning

De ovennævnte PCR-teknikker kræver dyrt termocyklisk udstyr til nøjagtigt at hæve og sænke kammertemperaturerne til denaturerings-, annealing- og forlængelsestrinnene.Der er udviklet en række teknikker, som ikke har brug for så præcise anordninger, og som kan udføres i et simpelt vandbad eller endda i cellerne af interesse.Disse teknikker kaldes samlet isotermisk forstærkning og arbejder baseret på eksponentiel, lineær eller kaskade forstærkning.

Den bedst kendte type isotermisk amplifikation er loop-medieret isoterm amplifikation eller LAMP.LAMP bruger eksponentiel amplifikation ved 65⁰C til at amplificere template-DNA eller RNA.Når der udføres LAMP, bruges fire til seks primere, der er komplementære til regioner af mål-DNA'et, med en DNA-polymerase til at syntetisere nyt DNA.To af disse primere har komplementære sekvenser, der genkender sekvenser i de andre primere og binder dem, hvilket muliggør, at der dannes en "loop"-struktur i det nyligt syntetiserede DNA, som så hjælper med primer-annealing i efterfølgende amplifikationsrunder.LAMP kan visualiseres ved flere metoder, herunder fluorescens, agarosegelelektroforese eller kolorimetri.Letheden ved at visualisere og detektere tilstedeværelsen eller fraværet af et produkt ved hjælp af kolorimetri og manglen på dyrt udstyr, der kræves, gjorde LAMP til en passende mulighed for SARS-CoV-2-test i områder, hvor klinisk laboratorietestning ikke var let tilgængelig, eller opbevaring og transport af prøver ikke var muligt, eller i laboratorier, der ikke tidligere havde PCR termocyklisk udstyr.