一、Forøg reaktionssystemets følsomhed：

1. Isoler RNA af høj kvalitet:

Succesfuld cDNA-syntese kommer fra RNA af høj kvalitet.RNA af høj kvalitet bør mindst være i fuld længde og fri for revers transkriptasehæmmere såsom EDTA eller SDS.Kvaliteten af ​​RNA bestemmer den maksimale mængde sekvensinformation, du kan transskribere til cDNA.En almindelig RNA-oprensningsmetode er en et-trins metode, der anvender guanidin isothiocyanat/syrephenol.For at forhindre kontaminering med spormængder af RNase skal RNA isoleret fra RNase-rige prøver (såsom bugspytkirtel) opbevares i formaldehyd for at bevare RNA af høj kvalitet, især til langtidsopbevaring.RNA'et ekstraheret fra rottelever blev grundlæggende nedbrudt efter at have været opbevaret i vand i en uge, mens RNA'et ekstraheret fra rottemilt forblev stabilt efter at have været opbevaret i vand i 3 år.Derudover er transkripter længere end 4 kb mere følsomme over for nedbrydning af spor-RNaser end små transkripter.For at øge stabiliteten af ​​lagrede RNA-prøver kan RNA opløses i deioniseret formamid og opbevares ved -70°C.Formamid, der bruges til at konservere RNA, skal være fri for RNA-nedbrydende affald.RNA fra bugspytkirtlen kan bevares i formamid i mindst et år.Når du forbereder dig på at bruge RNA, kan du bruge følgende metode til at præcipitere RNA: tilsæt NaCl til 0,2M og 4 gange volumen af ​​ethanol, anbring ved stuetemperatur i 3-5 minutter og centrifuger ved 10.000×g i 5 minutter.

2. Brug den RNaseH-inaktive (RNaseH-) reverse transkriptase：

RNase-hæmmere tilsættes ofte til reverse transkriptionsreaktioner for at øge længden og udbyttet af cDNA-syntese.RNase-hæmmere bør tilsættes under førstestrengssyntesereaktionen i nærværelse af en buffer og et reduktionsmiddel (såsom DTT), fordi processen forud for cDNA-syntese denaturerer inhibitoren og frigiver derved bundet RNase, der kan nedbryde RNA.Protein RNase-hæmmere forhindrer kun nedbrydning af RNA af RNase A, B, C og forhindrer ikke RNase på huden, så vær forsigtig med ikke at indføre RNase fra dine fingre på trods af brugen af ​​disse hæmmere.

Revers transkriptase katalyserer omdannelsen af ​​RNA til cDNA.Både M-MLV og AMV har endogen RNaseH-aktivitet ud over deres egen polymeraseaktivitet.RNaseH-aktivitet og polymeraseaktivitet konkurrerer med hinanden om hybridstrengen, der dannes mellem RNA-skabelonen og DNA-primeren eller cDNA-forlængelsestrengen, og nedbryder RNA-strengen i RNA:DNA-komplekset.RNA-skabelonen nedbrudt af RNaseH-aktivitet kan ikke længere tjene som et effektivt substrat for cDNA-syntese, hvilket reducerer udbyttet og længden af ​​cDNA-syntesen.Derfor ville det være fordelagtigt at eliminere eller i høj grad reducere RNaseH-aktiviteten af ​​revers transkriptase.

SuperScript Ⅱ revers transkriptase, RNaseH-MMLV revers transcriptase og thermoScript revers transcriptase, RNaseH-AMV, kan opnå mere mængde og mere fuldlængde cDNA end MMLV og AMV.RT-PCR-følsomhed vil blive påvirket af mængden af ​​cDNA-syntese.ThermoScript er meget mere følsomt end AMV.Størrelsen af ​​RT-PCR-produkter er begrænset af revers transkriptases evne til at syntetisere cDNA, især ved kloning af større cDNA'er.Sammenlignet med MMLV øgede SuperScripⅡ signifikant udbyttet af lange RT-PCR-produkter.RNaseH-revers transkriptasen har også øget termostabilitet, så reaktionen kan udføres ved temperaturer højere end de normale 37-42°C.Under de foreslåede syntesebetingelser skal du bruge oligo(dT)-primer og 10 μCi [α-P]dCTP.Det totale udbytte af første streng blev beregnet ved anvendelse af TCA-fældningsmetoden.Fuldlængde cDNA blev analyseret under anvendelse af størrelsessorterede bånd udskåret og talt på en alkalisk agarosegel.

3. Hæv inkubationstemperaturen for omvendt transkription:

En højere inkubationstemperatur hjælper med at åbne den sekundære RNA-struktur, hvilket øger udbyttet af reaktionen.For de fleste RNA-skabeloner vil inkubering af RNA og primere ved 65°C uden buffer eller salt, efterfulgt af hurtig afkøling på is, eliminere de fleste sekundære strukturer og tillade primere at binde.Nogle skabeloner har dog stadig sekundære strukturer, selv efter varmedenaturering.Amplifikation af disse vanskelige skabeloner kan udføres ved hjælp af ThermoScript revers transkriptase og placere revers transkriptionsreaktionen ved en højere temperatur for at forbedre amplifikationen.Højere inkubationstemperaturer kan også øge specificiteten, især når genspecifikke primere (GSP) bruges til cDNA-syntese (se kapitel 3).Hvis du bruger GSP, skal du sikre dig, at Tm for primerne er den samme som den forventede inkubationstemperatur.Brug ikke oligo(dT) og tilfældige primere over 60°C.Tilfældige primere kræver inkubation ved 25°C i 10 minutter, før de stiger til 60°C.Ud over at bruge en højere revers transkriptionstemperatur kan specificiteten også forbedres ved direkte at overføre RNA/primerblandingen fra 65°C denatureringstemperaturen til revers transkriptionsinkubationstemperaturen og tilføje en forvarmet 2x reaktionsblanding (cDNA hot-start syntese).Denne tilgang hjælper med at forhindre den intermolekylære baseparring, der opstår ved lavere temperaturer.Den multiple temperaturskift, der kræves til RT-PCR, kan forenkles ved at bruge en termisk cykler.

Den termostabile polymerase virker som en DNA-polymerase i nærvær af Mg2+ og som en RNA-polymerase i nærvær af Mn2+.Den kan holdes varm ved en maksimal temperatur på 65°C.Tilstedeværelsen af ​​Mn2+ under PCR reducerer imidlertid pålideligheden, hvilket gør Tth-polymerase mindre egnet til højpræcisionsforstærkning, såsom kloning af cDNA.Derudover har Tth lav revers transkriptionseffektivitet, hvilket reducerer følsomheden, og da revers transkription og PCR kan udføres med et enkelt enzym, kan kontrolreaktioner uden revers transkription ikke bruges til at sammenligne cDNA-amplifikationsprodukter med kontaminerende genomisk DNA.Amplifikationsprodukterne blev adskilt.

4. Tilsætningsstoffer, der fremmer omvendt transkription:

Additiver, herunder glycerol og DMSO, tilsættes til førstestrengssyntesereaktionen, hvilket kan reducere stabiliteten af ​​nukleinsyre-dobbeltstrengen og løse den sekundære struktur af RNA.Op til 20 % glycerol eller 10 % DMSO kan tilsættes uden at påvirke SuperScript II- eller MMLV-aktivitet.AMV kan også tåle op til 20 % glycerol uden tab af aktivitet.For at maksimere følsomheden af ​​RT-PCR i SuperScriptⅡ revers transkriptionsreaktionen kan 10% glycerol tilsættes og inkuberes ved 45°C.Hvis 1/10 af revers transkriptionsreaktionsproduktet tilsættes til PCR, så er koncentrationen af ​​glycerol i amplifikationsreaktionen 0,4 %, hvilket ikke er nok til at hæmme PCR.

5. RNaseH-behandling:

Behandling af cDNA-syntesereaktioner med RNaseH før PCR kan øge følsomheden.For nogle skabeloner menes det, at RNA i cDNA-syntesereaktionen forhindrer bindingen af ​​amplifikationsprodukter, i hvilket tilfælde RNaseH-behandling kan øge følsomheden.Generelt er RNaseH-behandling nødvendig, når man amplificerer længere cDNA-målskabeloner i fuld længde, såsom tuberøs scherosis II med lav kopi.For denne vanskelige skabelon forbedrede RNaseH-behandling signalet produceret af SuperScript II eller AMV-syntetiseret cDNA.For de fleste RT-PCR-reaktioner er RNaseH-behandling valgfri, fordi PCR-denatureringstrinnet ved 95°C generelt hydrolyserer RNA'et i RNA:DNA-komplekset.

6. Forbedring af metode til påvisning af lille RNA:

RT-PCR er især udfordrende, når kun små mængder RNA er tilgængelige.Glykogen tilføjet som en bærer under RNA-isolering hjælper med at øge udbyttet af små prøver.RNase-frit glykogen kan tilsættes samtidig med tilsætning af Trizol.Glykogen er vandopløseligt og kan holdes i den vandige fase med RNA for at hjælpe med efterfølgende udfældning.For prøver på mindre end 50 mg væv eller 106 dyrkede celler er den anbefalede koncentration af RNase-frit glykogen 250 μg/ml.

Tilføjelse af acetyleret BSA til den omvendte transkriptionsreaktion ved hjælp af SuperScript II kan øge følsomheden, og for små mængder RNA kan reduktion af mængden af ​​SuperScript II og tilføjelse af 40 enheder RNaseOut nukleaseinhibitor øge detektionsniveauet.Hvis glykogen anvendes i RNA-isoleringsprocessen, anbefales det stadig at tilføje BSA eller RNase-hæmmer, når SuperScript II anvendes til omvendt transkriptionsreaktion.

二、Forøg RT-PCR-specificitet

1. CND Asyntese:

Førstestrengs cDNA-syntese kan initieres ved hjælp af tre forskellige metoder, hvis relative specificitet påvirker mængden og typen af ​​syntetiseret cDNA.

Den tilfældige primermetode var den mindst specifikke af de tre metoder.Primere annealer på flere steder i hele transkriptet og genererer korte cDNA'er med delvis længde.Denne metode bruges ofte til at opnå 5'-endesekvenser og til at opnå cDNA fra RNA-skabeloner med regioner med sekundær struktur eller med termineringssteder, der ikke kan replikeres med revers transkriptase.For at opnå det længste cDNA skal forholdet mellem primere og RNA i hver RNA-prøve bestemmes empirisk.Startkoncentrationen af ​​tilfældige primere varierede fra 50 til 250 ng pr. 20 μl reaktion.Da cDNA syntetiseret fra totalt RNA under anvendelse af tilfældige primere primært er ribosomalt RNA, vælges poly(A)+RNA generelt som skabelonen.

Oligo(dT)-primere er mere specifikke end tilfældige primere.Det hybridiserer til poly(A) halen fundet i 3'-enden af ​​de fleste eukaryote mRNA'er.Fordi poly(A)+ RNA er ca. 1 % til 2 % af totalt RNA, er mængden og kompleksiteten af ​​cDNA meget mindre end med tilfældige primere.På grund af dets høje specificitet kræver oligo(dT) generelt ikke optimering af forholdet mellem RNA og primere og poly(A)+-selektion.Det anbefales at bruge 0,5 μg oligo(dT) pr. 20 μl reaktionssystem.oligo(dT)12-18 er velegnet til de fleste RT-PCR.ThermoScript RT-PCR-systemet tilbyder oligo(dT)20 på grund af dets bedre termiske stabilitet til højere inkubationstemperaturer.

Genspecifikke primere (GSP) er de mest specifikke primere til det omvendte transkriptionstrin.GSP er et antisense-oligonukleotid, der specifikt kan hybridisere til RNA-målsekvensen, i modsætning til tilfældige primere eller oligo(dT), som annealer til alle RNA'er.De samme regler, der bruges til at designe PCR-primere, gælder for design af GSP i reverse transkriptionsreaktioner.GSP'en kan være den samme sekvens som amplifikationsprimeren, der annealer til den 3'-endeste ende af mRNA'et, eller GSP'en kan designes til at anneale nedstrøms for den omvendte amplifikationsprimer.For nogle amplificerede forsøgspersoner skal mere end én antisense-primer designes til vellykket RT-PCR, fordi den sekundære struktur af mål-RNA'et kan forhindre primerbinding.Det anbefales at bruge 1 pmol antisense GSP i en 20 μl førstestrengssyntesereaktion.

2. Hæv inkubationstemperaturen for omvendt transkription:

For at drage fuld fordel af den fulde fordel ved GSP-specificitet bør der anvendes en revers transkriptase med højere termostabilitet.Termostabile reverse transkriptaser kan inkuberes ved højere temperaturer for at øge reaktionsstringensen.For eksempel, hvis en GSP annealer ved 55°C, vil specificiteten af ​​GSP'en ikke blive fuldt udnyttet, hvis AMV eller M-MLV anvendes til omvendt transkription ved en lav stringens på 37°C.SuperScript II og ThermoScript kan dog reageres ved 50°C eller højere, hvilket vil eliminere uspecifikke produkter genereret ved lavere temperaturer.For maksimal specificitet kan RNA/primerblandingen overføres direkte fra 65°C denatureringstemperaturen til revers transkriptionsinkubationstemperaturen og tilsættes til en forvarmet 2x reaktionsblanding (cDNA syntese varmstart).Dette hjælper med at forhindre intermolekylær baseparring ved lave temperaturer.De flere temperaturovergange, der kræves til RT-PCR, kan forenkles ved at bruge en termisk cyklus.

3. Reducerer genomisk DNA-kontamination:

En potentiel vanskelighed, man støder på med RT-PCR, er kontamineringen af ​​genomisk DNA i RNA'et.Brug af en god RNA-isoleringsmetode, såsom Trizol-reagens, vil reducere mængden af ​​genomisk DNA, der forurener RNA-præparatet.For at undgå produkter afledt af genomisk DNA kan RNA behandles med amplifikationsgrad DNase I for at fjerne kontaminerende DNA før revers transkription.DNase I-fordøjelsen blev afsluttet ved at inkubere prøverne i 2,0 mM EDTA i 10 minutter ved 65°C.EDTA kan chelatere magnesiumioner, hvilket forhindrer magnesiumionafhængig RNA-hydrolyse ved høje temperaturer.

For at adskille amplificeret cDNA fra kontaminerende genomiske DNA-amplifikationsprodukter kan primere designes, som hver annealer til adskille exoner.PCR-produkter afledt af cDNA vil være kortere end dem, der er afledt af kontamineret genomisk DNA.Derudover blev et kontroleksperiment uden revers transkription udført på hver RNA-skabelon for at bestemme, om et givet fragment var afledt af genomisk DNA eller cDNA.PCR-produktet opnået uden revers transkription er afledt af genomet.