Udgangsmateriale: RNA

Kvantitativ revers transkriptions-PCR (RT-qPCR) er en eksperimentel metode, der anvendes i PCR-eksperimenter med RNA som udgangsmateriale.I denne metode transskriberes total-RNA eller messenger-RNA (mRNA) først til komplementært DNA (cDNA) ved revers transkriptase.Efterfølgende blev en qPCR-reaktion udført under anvendelse af cDNA'et som skabelon.RT-qPCR er blevet brugt i en række molekylærbiologiske anvendelser, herunder genekspressionsanalyse, RNA-interferensvalidering, mikroarray-validering, patogendetektion, genetisk testning og sygdomsforskning.

Et-trins og to-trins metoder til RT-qPCR

RT-qPCR kan opnås ved en et-trins eller to-trins metode.Et-trins RT-qPCR kombinerer revers transkription og PCR-amplifikation, hvilket tillader revers transkriptase og DNA-polymerase at fuldføre reaktionen i det samme rør under de samme bufferbetingelser.Et-trins RT-qPCR kræver kun brug af sekvensspecifikke primere.I to-trins RT-qPCR udføres revers transkription og PCR-amplifikation i to rør ved hjælp af forskellige optimerede buffere, reaktionsbetingelser og primerdesignstrategier.

artikel 1

 

Fordel

Ulempe

Et skridt Denne metode har færre eksperimentelle fejl, da begge reaktioner udføres i et rør

 

Færre pipettering reducerer risikoen for kontaminering

 

Velegnet til high-throughput amplifikation/screening, hurtig og reproducerbar

To-trins reaktioner kan ikke optimeres separat

 

Da reaktionsbetingelserne kompromitteres ved at kombinere to-trins-reaktionen, er følsomheden ikke så god som for to-trins-metoden

 

Antallet af mål påvist af en enkelt prøve er lille

To trin Evne til at skabe stabile cDNA-biblioteker, der kan opbevares i lange perioder og bruges i flere reaktioner

 

Målgener og referencegener kan amplificeres fra det samme cDNA-bibliotek uden behov for flere cDNA-biblioteker

 

Reaktionsbuffere og reaktionsbetingelser, der muliggør optimering af enkelte reaktionskørsler

 

Fleksibelt valg af triggerbetingelser

Brug af flere rør og flere pipetteringstrin øger risikoen for DNA-kontamination,

og tidskrævende.

 

Kræver mere optimering end ettrinsmetoden

Relaterede produkter:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Grøn I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix til første-strengs CDNA-syntese

Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Udvælgelse af totalt RNA og mRNA

Når man designer et RT-qPCR-eksperiment, er det vigtigt at beslutte, om man skal bruge totalt RNA eller oprenset mRNA som skabelon til revers transkription.Selvom mRNA kan være i stand til at give lidt højere følsomhed, bruges total-RNA stadig hyppigt.Grunden til dette er, at total-RNA har en vigtigere fordel som udgangsmateriale end mRNA.For det første kræver processen færre oprensningstrin, hvilket sikrer bedre kvantitativ genvinding af skabelon og bedre normalisering af resultater til startcelletal.For det andet undgår den mRNA-berigelsestrinnet, som kan undgå muligheden for skæve resultater på grund af forskellige gendannelser af forskellige mRNA'er.Samlet set, da den relative kvantificering af målgenet i de fleste anvendelser er vigtigere end den absolutte følsomhed af påvisningen, er total RNA mere egnet i de fleste tilfælde.

Revers transkriptionsprimer

I to-trinsmetoden kan tre forskellige metoder anvendes til at prime cDNA-reaktionen: oligo(dT)-primere, tilfældige primere eller sekvensspecifikke primere.Typisk anvendes oligo(dT)-primere og tilfældige primere i kombination.Disse primere annealer til template-mRNA-strengen og giver revers transkriptase med et udgangspunkt for syntese.

artikel 2

Primer valg Struktur og funktion Fordel Ulempe
Oligo(dT) primer (eller forankret oligo(dT) primer) Forlænget annealing til thyminrester ved poly(A)-halen af ​​mRNA;ankeroligo(dT)-primer indeholder et G, C eller A i 3'-enden (ankersted) Syntese af fuldlængde cDNA fra poly(A)-halet mRNA

 

Gælder, når mindre udgangsmateriale er tilgængeligt

 

Forankringsstedet sikrer, at oligo(dT)-primeren binder til 5′ poly(A)-halen af ​​mRNA'et

Kun egnet til at amplificere gener med poly(A)-haler

 

Få cDNA trunkeret fra primingstedet*2 i poly(A)

 

Forspændt til at binde til 3′-enden*

 

*Denne mulighed minimeres, hvis der anvendes forankrede oligo(dT)-primere

tilfældig primer

 

6 til 9 baser i længden, som kan anneale til flere steder under RNA-transkription Anneal til alle RNA'er (tRNA, rRNA og mRNA)

 

Velegnet til transskriptioner med betydelig sekundær struktur, eller når mindre udgangsmateriale er tilgængeligt

 

Højt cDNA-udbytte

cDNA er omvendt transskriberet fra alt RNA, hvilket normalt ikke er ønsket og kan fortynde signalet fra mål-mRNA'et

 

få trunkeret cDNA

sekvensspecifikke primere Brugerdefinerede primere rettet mod specifikke mRNA-sekvenser specifikt cDNA-bibliotek

 

Forbedre følsomheden

 

Brug af reverse qPCR-primere

Kun begrænset til syntesen af ​​et enkelt målgen

Omvendt transkriptase

Revers transkriptase er et enzym, der bruger RNA til at syntetisere DNA.Nogle reverse transkriptaser har RNase-aktivitet og kan nedbryde RNA-strenge i RNA-DNA-hybridstrenge efter transkription.Hvis det ikke har RNase enzymatisk aktivitet, kan RNaseH tilføjes for højere qPCR-effektivitet.Almindeligt anvendte enzymer indbefatter Moloney murin leukæmivirus revers transkriptase og aviær myeloblastom virus revers transkriptase.For RT-qPCR er det ideelt at vælge en omvendt transkriptase med højere termostabilitet, så cDNA-syntese kan udføres ved højere temperaturer, hvilket sikrer vellykket transkription af RNA'er med højere sekundær struktur, samtidig med at deres fulde aktivitet opretholdes under hele reaktionen, hvilket resulterer i højere cDNA-udbytter.

Relaterede produkter:

Foreasy M-MLV omvendt transkriptase

RNase H-aktivitet af revers transkriptase

RNaseH er i stand til at nedbryde RNA-strenge fra RNA-DNA-duplekser, hvilket muliggør effektiv syntese af dobbeltstrenget DNA.Men når man bruger langt mRNA som skabelon, kan RNA'et blive nedbrudt for tidligt, hvilket resulterer i trunkeret cDNA.Derfor er det ofte fordelagtigt at minimere RNaseH-aktivitet under cDNA-kloning, hvis syntese af lange transkripter ønskes.I modsætning hertil er reverse transkriptaser med RNase H-aktivitet ofte gavnlige til qPCR-applikationer, fordi de øger smeltningen af ​​RNA-DNA-duplekser under den første cyklus af PCR.

Primer design

PCR-primere, der anvendes til qPCR-trinnet i RT-qPCR, bør ideelt set designes til at spænde over en exon-exon-forbindelse, hvor en amplifikationsprimer potentielt kan spænde over en faktisk exon-intron-grænse.Da intron-holdige genomiske DNA-sekvenser ikke amplificeres, reducerer dette design risikoen for falske positiver amplificeret fra kontaminerende genomisk DNA.

Hvis primere ikke kan designes til at adskille exoner eller exon-exon-grænser, kan det være nødvendigt at behandle RNA-prøver med RNase-fri DNase I eller dsDNase for at fjerne genomisk DNA-kontamination.

RT-qPCR kontrol

En revers transkriptionsnegativ kontrol (-RT-kontrol) bør inkluderes i alle RT-qPCR-eksperimenter for at påvise DNA-kontamination (såsom genomisk DNA eller PCR-produkter fra tidligere reaktioner).Denne kontrol indeholder alle reaktionskomponenter undtagen revers transkriptase.Da revers transkription ikke forekommer med denne kontrol, hvis PCR-amplifikation observeres, er kontaminering fra DNA mest sandsynlig.


Indlægstid: Aug-02-2022