• facebook
  • linkedin
  • Youtube

Sterilisering af pipettespidser og EP-rør mv.

1. Forbered 0,1 % (en tusindedel) DEPC (meget giftigt stof) med deioniseret vand, brug det forsigtigt i et stinkskab, og opbevar det ved 4°C væk fra lys;

DEPC-vand er rent vand behandlet med DEPC og steriliseret ved høj temperatur og højt tryk.Testet til at være fri for RNase, DNase og proteinase.

2. Sæt pipettespidsen og EP-røret i 0,1 % DEPC, og sørg for, at pipettespidsen og EP-røret er fyldt med 0,1 % DEP.

3. Beskyt mod lys, lad stå natten over (12-24 timer)

4. Æsken med spidsen og EP-røret behøver ikke at være gennemblødt i DEPC.Efter nogenlunde fjernelse af DEPC-vandet i spidsen eller EP-røret, pak det sammen og pak det ind.

5. 121 grader Celsius, 30min

6. 180 grader Celsius, tør i flere timer (mindst 3 timer)

Bemærk: a.Bær latexhandsker og -masker ved håndtering af DEPC!b, eller uden DEPC-sterilisering, 130 ℃, 90 min autoklave (mange laboratorier højtemperatursterilisering to gange)

RNA-ekstraktionsovervejelser

To store fænomener med vævs-RNA-isolationsfejl

RNA-nedbrydning og rester af urenheder i væv,angående nedbrydning, lad os først se på, hvorfor RNA ekstraheret fra dyrkede celler ikke let nedbrydes.Eksisterende RNA-ekstraktionsreagenser indeholder alle komponenter, der hurtigt hæmmer RNase.Tilføj lysatet til de dyrkede celler, og bland det blot, alle cellerne kan blandes grundigt med lysatet, og cellerne lyseres fuldstændigt.Efter at cellerne er lyseret, hæmmer de aktive ingredienser i lysatet straks den intracellulære RNase, så RNA'et forbliver intakt.Det vil sige, fordi de dyrkede celler let og fuldstændigt bringes i kontakt med lysatet, nedbrydes deres RNA ikke let;på den anden side nedbrydes RNA'et i vævet let, fordi cellerne i vævet ikke er nemme hurtigt at komme i kontakt med lysatet.på grund af tilstrækkelig kontakt.Så,forudsat at der er en måde at omdanne vævet til en enkelt celle, mens det hæmmer RNA-aktivitet, kunne problemet med nedbrydning være fuldstændig løst.

Flydende nitrogenformaling er den mest effektive sådan metode.Den flydende nitrogenformalemetode er dog meget besværlig, især når antallet af prøver er stort.Dette gav anledning til den næstbedste ting: homogenisatoren.Dethomogenisatormetoden overvejer ikke spørgsmålet om, hvordan RNase-aktivitet hæmmes, før celler bringes i kontakt med lysatet, men beder snarere om, at hastigheden af ​​vævsforstyrrelser er hurtigere end den hastighed, hvormed intracellulær RNase nedbryder RN.

Effekten af ​​elektrisk homogenisator er bedre,og effekten af ​​glashomogenisator er dårlig, men generelt kan homogenisatormetoden ikke forhindre nedbrydningsfænomenet.Derfor, hvis ekstraktionen forringes, bør den originale elektriske homogenisator bruges til formaling med flydende nitrogen;den originale glashomogenisator bør ændres til en elektrisk homogenisator eller males direkte med flydende nitrogen.Problemet er næsten 100% muligt.få løst.

Problemet med urenhedsrester, der påvirker efterfølgende eksperimenter, har flere forskellige årsager end nedbrydning, og løsningerne er tilsvarende forskellige.Afslutningsvis,hvis der er nedbrydning eller resterende urenheder i vævet, skal ekstraktionsmetoden/reagenset for det specifikke forsøgsmateriale optimeres.Du behøver ikke bruge dine dyrebare prøver til optimering: du kan købe nogle små dyr som fisk/kylling fra markedet, tage den tilsvarende del af materialet til RNA-ekstraktion, og den anden del til proteinekstraktion – male med mund, mave og tarm Ekstrakt.

Mål-RNA'et for det ekstraherede RNA bruges til forskellige opfølgningsforsøg, og dets kvalitetskrav er forskellige

cDNA-bibliotekskonstruktion kræver RNA-integritet uden rester af enzymreaktionsinhibitorer;Northern kræver højere RNA-integritet og lavere krav til rester af enzymreaktionsinhibitorer;RT-PCR kræver ikke for høj RNA-integritet,men hæmmer enzymreaktioner.Kravene til restprodukter er strenge.Indgangen bestemmer outputtet;hver gang målet er at opnå den højeste renhed RNA, vil det koste mennesker og penge.

Indsamling/opbevaring af prøver

Faktorer, der påvirker nedbrydning Efter prøven forlader den levende krop/eller det oprindelige vækstmiljø, vil de endogene enzymer i prøven begynde at nedbryde RNA,og nedbrydningshastigheden er relateret til indholdet af endogene enzymer og temperatur.Traditionelt er der kun to måder til fuldstændigt at inhibere endogen enzymaktivitet: tilsæt lysat med det samme og homogeniser grundigt og hurtigt;skær i små stykker og frys straks i flydende nitrogen.Begge tilgange kræver hurtig drift.Sidstnævnte er egnet til alle prøver, mens førstnævnte kun er egnet til væv med lavt indhold af celler og endogene enzymer og lettere at homogenisere.Specifikt kan plantevæv, lever, thymus, bugspytkirtel, milt, hjerne, fedt, muskelvæv osv. bedst fryses med flydende nitrogen, før du fortsætter.

Fragmentering og homogenisering af prøver

Faktorer, der påvirker nedbrydning og udbytte Prøvefragmentering erfor grundig homogenisering, som er til fuldstændig og fuldstændig frigivelse af RNA.Celler kan homogeniseres direkte uden at blive brudt.Væv kan kun homogeniseres efter at være blevet brudt.Gær og bakterier skal brydes med tilsvarende enzymer, før de kan homogeniseres.Væv med lavere endogent enzymindhold og lettere homogenisering kan knuses og homogeniseres på én gang i lysatet med en homogenisator;plantevæv, lever, thymus, bugspytkirtel, milt, hjerne, fedt, muskelvæv og andre prøver, De er enten høje i endogene enzymer eller er ikke let homogeniserede,så vævsforstyrrelse og homogenisering skal udføres separat.Den mest pålidelige og mest produktive metode til fragmentering er formaling med flydende nitrogen, og den mest pålidelige metode til homogenisering er brugen af ​​en elektrisk homogenisator.En særlig bemærkning om formaling med flydende nitrogen: Prøven må ikke optøs under hele formalingsprocessen, da endogene enzymer er mere tilbøjelige til at fungere, når de fryses.

Valg af lysat

Påvirker driftskomforten og faktorerne for resterende endogene urenheder. De almindeligt anvendte lyseringsopløsninger kan næsten hæmme aktiviteten af ​​RNase.Derfor er nøglepunktet ved at vælge en lyseringsopløsning at overveje i kombination med oprensningsmetoden.Der er én undtagelse:prøver med højt endogent enzymindhold anbefales at bruge et lysat indeholdende phenol for at øge evnen til at inaktivere endogene enzymer.

Valg af rensemetode

Faktorer, der påvirker resterende endogene urenheder, ekstraktionshastighed For rene prøver, såsom celler, kan der opnås tilfredsstillende resultater med næsten enhver oprensningsmetode ved hånden.Men for mange andre prøver, især dem med høje niveauer af urenheder såsom planter, lever, bakterier osv., er det afgørende at vælge en passende oprensningsmetode.Søjlecentrifugaloprensningsmetoden har en hurtig ekstraktionshastighed og kan effektivt fjerne urenheder, der påvirker den efterfølgende enzymatiske reaktion af RNA, men den er dyr (Foregene kan tilbyde omkostningseffektive sæt, flere detaljer klikher);ved hjælp af økonomiske og klassiske oprensningsmetoder, såsom LiCl-udfældning, kan der også opnås tilfredsstillende resultater, men driftstiden er lang..

"Tre discipliner og otte opmærksomheder" til RNA-ekstraktion

Disciplin 1:Sæt en stopper for forurening af eksogene enzymer.

Note 1:Bær strengt masker og handsker.

Note 2:De centrifugerør, spidshoveder, pipettestænger, elektroforesetanke og forsøgsbænke, der er involveret i eksperimentet, skal bortskaffes grundigt.

Note 3:Reagenserne/opløsningerne involveret i eksperimentet, især vand, skal være RNase-fri.

Disciplin 2:Bloker aktiviteten af ​​endogene enzymer

Note 4:Vælg en passende homogeniseringsmetode.

Note 5:Vælg et passende lysat.

Note 6:Kontroller startmængden af ​​prøven.

Disciplin 3:Afklar dit udvindingsformål

Note 7:Når ethvert lysatsystem nærmer sig den maksimale startmængde af prøve, falder succesraten for ekstraktion kraftigt.

Note 8:Det eneste økonomiske kriterium for vellykket RNA-ekstraktion er en succes i efterfølgende eksperimenter, ikke udbytte.

Top 10 kilder til RNase-kontamination

1. Fingre er den første kilde til eksogene enzymer, så handsker skal bæres og udskiftes ofte.Derudover skal der også bæres masker, for vejrtrækning er også en vigtig kilde til enzymer.En yderligere fordel ved at bære en handskemaske er at beskytte forsøgslederen.

2. Pipettespidser, centrifugerør, pipetter – RNase kan ikke inaktiveres ved sterilisering alene, så pipettespidser og centrifugerør bør behandles med DEPC, selvom de er mærket som DEPC behandlede.Det er bedst at bruge en specialpipette, tør den af ​​med en 75% alkohol vatkugle før brug, især stangen;desuden skal du sørge for ikke at bruge en hovedfjerner.

3. Vandet/bufferen skal være fri for RNase-kontamination.

4. Testbordet skal i det mindste tørres af med 75% alkohol vatkugler.

5.Endogene RNase Alle væv indeholder endogene enzymer, så hurtig nedfrysning af væv med flydende nitrogen er den bedste måde at reducere nedbrydning på.Metoden til opbevaring/formaling af flydende nitrogen er faktisk ubelejlig, men det er den eneste måde for væv med høje niveauer af endogene enzymer.

6. RNA-prøver RNA-ekstraktionsprodukter kan indeholde spor af RNase-kontamination.

7. Plasmidekstraktion Plasmidekstraktion bruger ofte RNAse til at nedbryde RNA, og den resterende RNAse bør fordøjes med Proteinase K og ekstraheres med PCI.

8. RNA-opbevaring Selvom det opbevares ved lav temperatur, vil spormængder af RNase forårsage RNA-nedbrydning.Den bedste løsning til langtidskonservering af RNA er en salt/alkohol-suspension, fordi alkohol hæmmer al enzymatisk aktivitet ved lave temperaturer.

9. Når kationer (Ca, Mg) indeholder disse ioner, vil opvarmning ved 80C i 5 minutter medføre, at RNA spaltes, så hvis RNA skal opvarmes, skal konserveringsopløsningen indeholde et chelateringsmiddel (1mM natriumcitrat, pH 6,4).

10. Enzymer anvendt i efterfølgende eksperimenter kan være kontamineret med RNase.

10 tips til RNA-ekstraktion

1: Forebyg hurtigt RNase-aktivitet.Prøver fryses hurtigt efter indsamling, og RNase inaktiveres ved hurtig drift under lysis.

2: Vælg en passende ekstraktionsmetode for væv med højt ribozymindhold, og fedtvæv er bedst at bruge metoden, der indeholder phenol.

3: Forudsigelseskvalitet kræver Northern, cDNA-bibliotekskonstruktion kræver høj integritet, og RT-PCR og RPA (Ribonuclease Protection assay) kræver ikke høj integritet.RT-PCR kræver høj renhed (enzyminhibitorrester).

4: Grundig homogenisering er nøglen til at forbedre udbyttet og reducere nedbrydningen.

5: Tjek integriteten af ​​RNA-elektroforesedetektion, 28S: 18S = 2:1 er et fuldstændigt tegn, 1:1 er også acceptabelt for de fleste eksperimenter.

6: Fjernelse af DNA til RT-PCR, array-analyse Det er bedst at bruge Dnase I til at fjerne DNA.

7: Reducer forureningen af ​​eksogene enzymer – enzymer kan ikke importeres udefra.

8: Ved koncentrering af nukleinsyre med lav koncentration bør der tilsættes et co-præcipitationsreagens.Men for at forhindre, at co-præcipitanten indeholder enzymer og DNA-kontamination.

9: Opløs RNA'et grundigt, opvarm om nødvendigt ved 65C i 5 minutter.

passende opbevaringsmetode

Den kan opbevares ved -20C i kort tid og ved -80C i lang tid.Det første skridt i at forbedre RNA-udbyttet er at indse, at RNA-indholdet i forskellige prøver varierer meget.Høj mængde (2-4 ug/mg) såsom lever, bugspytkirtel, hjerte, medium mængde (0,05-2 ug/mg) såsom hjerne, embryo, nyre, lunge, thymus, æggestok, lav mængde (<0,05 ug/mg) mg) såsom blære, knogler, fedt.

1: Lyser celler for at frigive RN – hvis RNA ikke frigives, vil udbyttet blive reduceret.Elektrisk homogenisering fungerer bedre end andre homogeniseringsmetoder, men skal muligvis også kombineres med andre metoder, såsom flydende nitrogenmæskning, enzymatisk fordøjelse (Lysozyme/Lyticase)

2: Optimering af udvindingsmetoden.De største problemer med phenol-baserede metoder er ufuldstændig stratificering og delvist RNA-tab (supernatanten kan ikke fjernes fuldstændigt).Ufuldstændig stratificering skyldes højt nukleinsyre- og proteinindhold, som kan løses ved at øge mængden af ​​anvendt lysat eller reducere mængden af ​​prøve.Et trin med chloroformekstraktion blev tilsat til fedtvævet.RNA-tab kan reduceres ved tilbagepumpning eller ved at fjerne det organiske lag efterfulgt af centrifugering.Det største problem med kolonnecentrifugering-baserede metoder er overskydende prøve.

Klassiske udvindingstips

1. Phenolrensning: Tilsæt et lige så stort volumen 1:1 Phenol/Chloroform og bland kraftigt i 1-2 minutter.Centrifuger ved høj hastighed i 2 minutter.Fjern forsigtigt supernatanten (80-90%).Kom aldrig til mellemlaget.Et lige så stort volumen af ​​reaktionsopløsningen kan tilsættes til phenol/chloroform, og supernatanten fjernes.De to supernatanter kan blandes sammen til nukleinsyrepræcipitation for at forbedre udbyttet.Vær ikke for blid, når du blander, og prøv ikke at fjerne al supernatanten.

2. Vask med 70-80 % ethanol: Under vask skal nukleinsyren suspenderes for at sikre, at restsaltet vaskes væk.Samtidig, umiddelbart efter hældning af ethanolen, centrifugeres ved høj hastighed i et par sekunder, og derefter fjernes den resterende ethanol med en pipette.Opløses efter at have stået ved stuetemperatur i 5-10 minutter.

11. Udvinding af specialorganisationer

1. Fibrøst væv: Nøglen til RNA-ekstraktion fra fibrøst væv såsom hjerte/skeletmuskulatur er fuldstændig at forstyrre vævet.Disse væv har lav celletæthed, så mængden af ​​RNA pr. vægtenhed væv er lav, og det er bedst at bruge så meget startmængde som muligt.Sørg for at male vævet grundigt under fryseforhold.

2. Væv med højt protein/fedtindhold: hjerne/vegetabilsk fedtindhold er højt.Efter PCI-ekstraktion indeholder supernatanten hvide flokkuler.Supernatanten skal genekstraheres med chloroform.

3. Væv med højt nukleinsyre/ribozymindhold: milten/thymus har højt nukleinsyre- og ribozymindhold.Slibning af væv under fryseforhold efterfulgt af hurtig homogenisering kan effektivt inaktivere ribozymer.Men hvis lysatet er for viskøst (på grund af højt nukleinsyreindhold), vil PCI-ekstraktionen ikke være i stand til at stratificere effektivt;tilføjelse af mere lysat kan løse dette problem.Flere PCI-ekstraktioner kan fjerne mere resterende DNA.Hvis der dannes et hvidt bundfald umiddelbart efter tilsætning af alkohol, indikerer det DNA-kontaminering.Genekstraktion med sur PCI efter opløsning kan fjerne DNA-kontamination.

4. Plantevæv: Plantevæv er mere komplekst end dyrevæv.Generelt formales planter under flydende nitrogenforhold, så RNA-nedbrydning af endogene enzymer er ualmindeligt.Hvis nedbrydningsproblemet ikke er løst, er det næsten sikkert forårsaget af urenheder indeholdt i prøven.Urenhederne indeholdt i mange planter vil føre til rester, og årsagen til rester er ofte, fordi disse urenheder har nogle ligheder med RNA: du udfælder og jeg udfælder, og du adsorberer og jeg adsorberer.Disse egenskaber bestemmer, at de er meget stærke enzymhæmmere.

På nuværende tidspunkt kan kommercielle RNA-ekstraktionsreagenser tilpasses til næsten alle dyrevæv med små justeringer, men der er få kommercielle RNA-ekstraktionsreagenser, der kan være egnede til de fleste plantevæv.Heldigvis kan Foregene yde særligeplante-RNA-ekstraktionssæt, vi harPlant Total RNA Isolation kit, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Sidstnævnte er specielt designet til planter med højt indhold af polysaccharider og polyphenoler.Til RNA-ekstraktion er feedback fra laboratoriebrugere særlig god.

12. Effekten af ​​prøvefrysning og optøning Den frosne prøve kan være større, og den skal skæres, før den bruges til RNA-ekstraktion.Prøver har tendens til at smelte (muligvis delvist) under skæring.Frosne prøver skal muligvis vejes før RNA-ekstraktion, og optøning vil helt sikkert ske under denne proces.Nogle gange sker optøning af prøven også under formalingsprocessen med flydende nitrogen;eller den frosne prøve tilsættes direkte til lysatet uden formaling af flydende nitrogen, og optøning vil helt sikkert ske før den fuldstændige homogenisering.Eksperimenter har vist, at frosset væv er mere tilbøjeligt til RNA-nedbrydning under optøning end frisk væv.Den sandsynlige årsag: Fryse-tø-processen forstyrrer strukturer i cellen, hvilket gør det lettere for endogene enzymer at komme i direkte kontakt med RNA'et.

13. Bedømmelse af RNA-kvalitet Normalt bruges elektroforese til at bedømme RNA's integritet, og A260/A280 bruges til at bedømme RNA's renhed.I teorien har intakt RNA et forhold på 28S:18S = 2,7:1, og de fleste data understreger forholdet 28S:18S = 2:1.Faktum er, at næsten ingen af ​​RNA'et ekstraheret fra andre prøver end celler er i et 2:1-forhold (dette blev opnået ved hjælp af Agilent Bioanalyzer).

RNA's elektroforeseresultater påvirkes af mange faktorer, herunder sekundær struktur, elektroforesebetingelser, prøvebelastning, mætningsgrad med EB osv. Brug naturlig elektroforese til at detektere RNA og brug DNA-markør som kontrol.Hvis 28S ved 2 kb og 18S ved 0,9 kb er klare, og 28S: 18S > 1, kan integriteten opfylde kravene i de fleste efterfølgende eksperimenter.

A260/A280 er en indikator, der har skabt en del forvirring.Først og fremmest er det nødvendigt at afklare den oprindelige betydning af denne indikator for nukleinsyrer: rent RNA, dets A260/280 = omkring 2,0.Rent RNA er 'årsagen' og A260/A280 = 2 er 'virkningen'.Nu bruger alle A260/A280 som en 'årsag' og tænker, at "hvis A260/A280 = 2, så er RNA rent", hvilket naturligvis fører til forvirring.

Hvis du er interesseret, kan du tilføje lidt reagens, der ofte bruges i ekstraktion, såsom phenol, guanidin isothiocyanat, PEG osv., til din RNA-prøve og derefter måle A260/A280-forholdet.Virkeligheden er, at mange af de reagenser, der bruges til RNA-ekstraktion, såvel som mange urenheder i prøven, absorberer omkring A260 og A280, hvilket påvirker A260/A280.

Den mest lærerige tilgang på nuværende tidspunkt er at scanne RNA-prøver i området 200-300 nm.Kurven af ​​rent RNA har følgende karakteristika: kurven er glat, A230 og A260 er to bøjningspunkter, A300 er tæt på 0, A260/A280 = omkring 2,0 og A260/A230 = omkring 2,0.Hvis scanningsdata ikke er tilgængelige, skal A260/A230-forholdet også bestemmes, da dette forhold er mere følsomt over for overførsel af alle urenheder, der påvirker den enzymatiske reaktion.Tag højde for enhedens lineære rækkevidde (0,1–0,5 for A260).

Der er to andre nyttige fænomener: forholdet vil være omkring 0,3 lavere, når A260/A280 måles i vand;mens forholdet målt i 10 mM EDTA er ca. 0,2 højere end det målt i 1 mM EDTA.

Relaterede produkter:

Kina Plant Total RNA Isolation Kit Producent og leverandør |Foregene (foreivd.com)

RNA isolation series Leverandører og fabrik |Kina RNA isolation serie fabrikanter (foreivd.com)

RNA-isoleringsserie – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)


Indlægstid: 15-jul-2022