Flere revolutionerende opfindelser i detektionsteknologiens historie er i mit sind immunmærkningsteknologi baseret på princippet om antigen-antistof-specifik binding, PCR-teknologi og sekventeringsteknologi.I dag vil vi tale om PCR-teknologi.Ifølge udviklingen af PCR-teknologi opdeler folk normalt PCR-teknologi i tre generationer: almindelig PCR-teknologi, real-time fluorescerende kvantitativ PCR-teknologi og digital PCR-teknologi.
Calmindelig PCR-teknik
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis opfandt polymerasekædereaktionen (polymerasekædereaktion , PCR) i 1983. Det siges, at da han kørte sin kæreste, fik han pludselig et glimt af inspiration og tænkte på princippet om PCR (om fordelene ved at køre bil).Kary Mullis blev tildelt Nobelprisen i kemi i 1993. New York Times kommenterede: "Meget original og betydningsfuld, næsten opdeling af biologi i præ-PCR og post-PCR epoker.
PCR-princippet: Under katalyse af DNA-polymerase anvendes moderstrengs-DNA'et som skabelon, og den specifikke primer bruges som udgangspunkt for forlængelse, og datterstrengs-DNA, der er komplementært til moderstrengsskabelon-DNA'et, kopieres in vitro gennem denaturering, annealing, forlængelse og andre trin.Det er en DNA-syntese-amplifikationsteknologi in vitro, som hurtigt og specifikt kan amplificere ethvert mål-DNA in vitro.
Fordele ved almindelig PCR
1.Klassisk metode, komplette internationale og indenlandske standarder
2.Lavere omkostninger til instrumentreagenser
3.PCR-produkter kan genvindes til andre molekylærbiologiske eksperimenter
Anbefalet Foregene PCR-maskine: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Relaterede produkter: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Ulemper ved almindelig PCR
1.let at forurene
2.besværlig drift
3.kun kvalitativ analyse
4.Moderat følsomhed
5.Der er ikke-specifik amplifikation, og når det ikke-specifikke bånd har samme størrelse som målbåndet, kan det ikke skelnes
Capillær elektroforese-baseret PCR
Som svar på manglerne ved almindelig PCR har nogle producenter introduceret instrumenter baseret på princippet om kapillær elektroforese.Elektroforesetrinnet efter PCR-amplifikation er afsluttet i kapillæren.Følsomheden er højere, og forskellen på flere baser kan skelnes, og forstærkningen kan beregnes af MAERKER.produktindhold.Ulempen er, at PCR-produktet stadig mangler at blive åbnet og sat ind i instrumentet, og der er stadig stor risiko for kontaminering.
CapillærEelektroforese
2. Real-time fluorescerende kvantitativ PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) teknologiFluorescerende kvantitativ PCR, også kaldet Real-Time PCR, er en ny kvantitativ nukleinsyreteknologi udviklet af PE (Perkin Elmer) i 1995. Udviklingshistorien for fluorescerende kvantitativ PCR er en historie med sjælsrørende kampe for giganter som ABI, Roche og Bio-Rad.Hvis du er interesseret, kan du tjekke det ud.Denne teknik er i øjeblikket den mest modne og mest udbredte semi-kvantitative PCR-teknik.
Anbefalet qPCR-maskine: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Fluorescerende farvemetode (SYBR Green I):SYBR Green I er det mest almindeligt anvendte DNA-bindende farvestof til kvantitativ PCR, som binder uspecifikt til dobbeltstrenget DNA.I den frie tilstand udsender SYBR Green svag fluorescens, men når den først er bundet til dobbeltstrenget DNA, øges dens fluorescens 1000 gange.Derfor er det totale fluorescerende signal, der udsendes af en reaktion, proportionalt med mængden af dobbeltstrenget DNA, der er til stede, og vil stige med stigningen af amplificeret produkt.Da farvestoffet binder uspecifikt til dobbeltstrenget DNA, kan der genereres falsk positive resultater.
Relaterede produkter: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Fluorescerende sondemetode (Taqman-teknologi): UnderPCR-amplifikation, en specifik fluorescerende probe tilføjes samtidig med et par primere.Proben er et lineært oligonukleotid med henholdsvis en fluorescerende reportergruppe og en fluorescerende quenchergruppe mærket i begge ender.Når proben er intakt, absorberes det fluorescerende signal, der udsendes af reportergruppen, af quenchergruppen, og detektionen. Der er intet fluorescerende signal;under PCR-amplifikation (i forlængelsesstadiet), vil 5'-3' Dicer-aktiviteten af Taq-enzymet fordøje og nedbryde proben, således at reporter-fluorescensgruppen og quencher-fluorescensgruppen adskilles, således at fluorescensmonitoreringssystemet Det fluorescerende signal kan modtages, dvs. hver gang en DNA-kæde forstærkes til akkumulering af fluorescensen af fluorescerende molekyle, hvilket fluorescerende akkumulering. ulering af fluorescerende signaler og dannelse af PCR-produkter.Taqman-sondemetoden er den mest almindeligt anvendte detektionsmetode i klinisk detektion.
Relaterede produkter: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Fordele ved qPCR
1.Metoden er moden, og det understøttende udstyr og reagenser er komplette
2.Middelpris for reagenser
3.let at bruge
4.Høj detektionsfølsomhed og specificitet
Ulemper ved qPCR
Mutationen af målgenet fører til manglende påvisning.
Detektionsresultatet af skabelon med lav koncentration kan ikke bestemmes.
Der er en stor fejl ved brug af standardkurven til kvantitativ detektion.
3. Digital PCR (digital PCR, dPCR) teknologi
Digital PCR er en teknik til absolut kvantificering af nukleinsyremolekyler.Sammenlignet med qPCR kan digital PCR direkte aflæse antallet af DNA/RNA-molekyler, som er den absolutte kvantificering af nukleinsyremolekyler i startprøven.I 1999 foreslog Bert Vogelstein og Kenneth W. Kin-zler formelt konceptet dPCR.
I 2006 var Fluidigm den første til at producere et kommercielt chip-baseret dPCR-instrument.I 2009 lancerede Life Technologies OpenArray og QuantStudio 12K Flex dPCR-systemerne.I 2013 lancerede Life Technologies QuantStudio 3DdPCR-systemet, som bruger højdensitets nanoskala mikrofluidisk chipteknologi til at fordele prøver jævnt til 20.000 individuelle celler.i reaktionsbrønden.
I 2011 lancerede Bio-Rad det dråbebaserede QX100 dPCR-instrument, som bruger vand-i-olie-teknologi til jævnt at fordele prøven til 20.000 dråber-vand-i-olie, og bruger en dråbeanalysator til at analysere dråberne.I 2012 lancerede RainDance RainDrop dPCR-instrumentet, drevet af højtryksgas, for at opdele hvert standardreaktionssystem i en reaktionsemulsion indeholdende 1 million til 10 millioner mikrodråber på picoliterniveau.
Indtil videre har digital PCR dannet to store fraktioner, chiptype og dråbetype.Uanset hvilken slags digital PCR, er dens kerneprincipper begrænsning af fortynding, endepunkts-PCR og Poisson-distribution.Standard PCR-reaktionssystemet, der indeholder nukleinsyreskabeloner, er jævnt opdelt i titusindvis af PCR-reaktioner, som fordeles til chips eller mikrodråber, således at hver reaktion indeholder så meget som muligt et skabelonmolekyle, og der udføres en enkelt-molekyle skabelon PCR-reaktion.Ved aflæsning af fluorescensen tælles tilstedeværelsen eller fraværet af signalet, og den absolutte kvantificering udføres efter kalibrering af den statistiske Poisson-fordeling.
Følgende er karakteristika for flere digitale PCR-platforme, jeg har brugt:
1. Bio-Rad QX200 dråbe digital PCR Bio-RadQX200 er en meget klassisk digital PCR-platform, den grundlæggende detektionsproces: 20.000 prøver genereres af dråbegeneratoren Vand-i-olie mikrodråber forstærkes på en almindelig PCR-maskine, og til sidst aflæses fluorescenssignalet fra hver mikrodråbe af en mikrodråbelæser.Operationen er mere kompliceret, og risikoen for forurening er middel.
Xinyi TD1 mikrodråbe digital PCRXinyi TD1 er en indenlandsk digital PCR-platform, den grundlæggende detektionsproces: generer 30.000-50.000 vand-i-olie-dråber gennem en dråbegenerator, forstærk på et almindeligt PCR-instrument og passer til sidst. Dråbelæseren læser det fluorescerende signal for hver dråbe.Både generering af dråber og aflæsning i denne platform udføres i en dedikeret chip med lav risiko for kontaminering.
STILLA Naica mikrodråbechip digital PCRSTILLA Naica er en relativt ny digital PCR-platform.Den grundlæggende detektionsproces er: Tilføj reaktionsopløsningen til chippen, sæt chippen ind i mikrodråbegenererings- og amplifikationssystemet og generer 30.000 mikrodråber.Spredt på chippen, og PCR-amplifikation er fuldført på chippen.Derefter overføres den forstærkede chip til mikrodråbeaflæsningsanalysesystemet, og det fluorescerende signal aflæses ved at tage billeder.Da hele processen foregår i en lukket chip, er risikoen for forurening lav.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D-chip digital PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D er en anden klassisk chip-baseret digital PCR-platform.Dens grundlæggende detektionsproces er: tilsæt reaktionsopløsningen i sprederen, og spred reaktionsopløsningen jævnt på chippen med 20.000 mikrobrønde gennem sprederen., sæt chippen på PCR-maskinen for at forstærke, og sæt til sidst chippen i læseren og tag et billede for at læse det fluorescerende signal.Operationen er forholdsvis kompliceret, og hele processen udføres i en lukket chip, og risikoen for forurening er lav.
5. JN MEDSYS Clarity chip digital PCR
JN MEDSYS Clarity er en relativt ny digital PCR-platform af chiptypen.Dens grundlæggende detektionsproces er: tilsæt reaktionsopløsningen i applikatoren, og fordel reaktionsopløsningen jævnt på 10.000 PCR-rør fastgjort i PCR-røret gennem applikatoren.På den mikroporøse chip kommer reaktionsopløsningen ind i chippen gennem kapillærvirkning, og PCR-røret med chippen placeres på PCR-maskinen til amplifikation, og til sidst sættes chippen ind i læseren for at aflæse det fluorescerende signal ved at tage et foto.Operationen er mere kompliceret.Risikoen for forurening er lav.
Parametrene for hver digital PCR-platform er opsummeret som følger:
Evalueringsindikatorerne for den digitale PCR-platform er: antallet af delte enheder, antallet af fluorescerende kanaler, kompleksiteten af driften og risikoen for kontaminering.Men det vigtigste er detektionsnøjagtigheden.En måde at evaluere digitale PCR-platforme på er at bruge flere digitale PCR-platforme til at verificere hinanden, og en anden måde er at bruge standardstoffer med nøjagtige værdier.
Fordele ved dPCR
1.At opnå absolut kvantificering
2.Højere sensitivitet og specificitet
3.Kan detektere prøver med lavt antal kopier
Ulemper ved dPCR1. Dyrt udstyr og reagenser 2. Kompliceret drift og lang detektionstid 3. Snævert detektionsområde
På nuværende tidspunkt har de tre generationer af PCR-teknologi deres egne fordele og ulemper, og hver har sine egne anvendelsesområder, og det er ikke et forhold, at den ene generation afløser den anden.Den kontinuerlige udvikling af teknologien har injiceret ny vitalitet i PCR-teknologien, hvilket gør den i stand til at låse den ene applikationsretning op efter den anden, hvilket gør nukleinsyredetektion mere bekvem og præcis.
Kilde: Dr. Yuan tager dig med til test
Anbefalede produkter:
Indlægstid: 18. november 2022
