• facebook
  • linkedin
  • Youtube

1. Påvis absorbansen af ​​RNA-opløsning

Absorbans ved 280, 320, 230 og 260 nm repræsenterer værdierne af henholdsvis nukleinsyre, baggrund (opløsningsturbiditet), saltkoncentration og organisk materiale såsom protein.Generelt kun se på OD260/OD280 (Ratio, R).Når 1,8~2,0, tror vi, at forurening af protein eller andet organisk materiale i RNA kan tolereres, men det skal bemærkes, at når Tris bruges som buffer til at detektere absorbansen, kan R-værdien være større end 2 (generelt skal den være <2,2).Når R<1,8 er forureningen af ​​protein eller andet organisk stof i opløsningen mere tydelig, og RNA'ets skæbne kan bestemmes efter behov.Når R>2,2 betyder det, at RNA er blevet hydrolyseret til en enkelt nukleinsyre.
 
2. Elektroforetisk mønster af RNA
Generelt bruges denaturerende gel til RNA-elektroforese, men hvis det kun er til at påvise kvaliteten af ​​RNA, er denaturerende gel ikke nødvendig, og almindelig agarosegel kan bruges.Formålet med elektroforese er at detektere integriteten af ​​28S- og 18S-bånd og deres forhold, eller integriteten af ​​mRNA-udstrygning.Generelt, hvis 28S- og 18S-båndene er lyse, klare og skarpe (hvis kanterne af båndene er klare), og lysstyrken af ​​28S er mere end dobbelt så høj som for 18S-båndet, anser vi kvaliteten af ​​RNA'et for at være god.
Ovenstående er de to metoder, vi almindeligvis bruger, men ingen af ​​disse to metoder kan tydeligt fortælle os, om der er resterende RNase i RNA-opløsningen.Hvis der er en meget lille mængde RNase i opløsningen, er det svært for os at påvise det med ovenstående metode, men de fleste af de efterfølgende enzymatiske reaktioner udføres ved over 37 grader og i lang tid.På denne måde, hvis der er en meget lille mængde RNase i RNA-opløsningen, så vil der være et meget passende miljø og tid til at spille deres rolle i de efterfølgende forsøg, og selvfølgelig vil forsøget være koldt på dette tidspunkt.Nedenfor introducerer vi en metode, der kan bekræfte, om der er resterende RNase i RNA-opløsningen.
 
3. Varmekonserveringstest
I henhold til prøvekoncentrationen trækkes to 1000 ng RNA fra RNA-opløsningen og tilsættes det til et 0,5 ml centrifugerør og suppleres med pH 7,0 Tris-buffer til et samlet volumen på 10 ul, og derefter forsegle hætten på røret.Sæt en af ​​dem i et vandbad med konstant temperatur ved 70°C og hold det varmt i 1 time.Den anden del blev opbevaret i et -20°C køleskab i 1 time.Når tiden er gået, fjern de to prøver til elektroforese.Når elektroforesen er afsluttet, skal du sammenligne de elektroforetiske bånd af de to.Hvis båndene af de to er konsistente eller ikke har nogen signifikant forskel (deres bånd opfylder naturligvis også betingelserne i metode 2), betyder det, at der ikke er nogen resterende RNase-kontamination i RNA-opløsningen, og kvaliteten af ​​RNA'et er meget god.Tværtimod, hvis prøven inkuberet ved 70°C viser tydelig nedbrydning, indikerer det, at der er RNase-kontamination i RNA-opløsningen.
 
2 Eksperimentelle metoder og teknikker til RNA-ekstraktion
De problemer, vi ofte støder på, når vi ekstraherer RNA, er: (1) RNA-udbyttet er lavt;(2) RNA har alvorlig saltforurening;(3) RNA har alvorlig organisk opløsningsmiddelforurening;(4) prøvenedbrydning og andre problemer
 
1. Almindeligt anvendte total-RNA-ekstraktionsreagenser
Guanidin-isothiocyanat-metoden og Trizol-metoden er de mest almindeligt anvendte metoder til ekstraktion af totalt RNA fra dyrevæv og dyreceller.Det er især velegnet til små prøver og væv, der er særligt vanskelige at ekstrahere, såsom ekstraktion af totalt RNA fra kaninhud og dyrebindevæv;derudover kan Trizol, som et lyse-reagens til generelle formål, også bruges til ekstraktion af plantevæv, bakterier, svampe og andet væv.Til plantevæv indeholdende polysaccharider og polyphenoler, såsom camellia oleifera, teblade, raps, etc., kan CTAB-metoden også bruges til at ekstrahere total-RNA.

Som en konventionel metode er dobbeltsøjlemetoden også meget populær på grund af dens normale temperaturdrift, ingen grund til at tilføje RNase og sikkerhed - ingen chloroform, phenoler og andre organiske reagenser til ekstraktion.(anbefalede produkter )

1
2

2. Ekstraktion af totalt RNA fra dyrevæv
 
(1) Prøv at vælge frisk væv, hvis det ikke er frisk (helst inden for tre måneder - 80 ℃ køleskab eller frosset i flydende nitrogen. Når du skærer væv, skær ikke direkte ved stuetemperatur, sørg for at Læg det på isboksen, prøv at undgå gentagen frysning og optøning.
(2) Brug en ren saks og pincet til at klippe et lille stykke væv, prøv at skære den centrale del af vævet, når du skærer prøven, eller klip først det store stykke væv fra midten, og klip derefter prøven ved den friske indsnitsposition.Det fjernede væv skal strimles fuldstændigt, anbring det strimlede væv i et EP-rør uden RNase, tilsæt lysatet, det strimlede væv skal eksponeres helt for lysatet og forberede homogenisering.

(3) For normalt væv vælges væv på størrelse med mungbønne (30-60 mg) til homogenisering.Hvis vævene indeholder en stor mængde protein, fedt eller tæt fibrøst væv som f.eks. lever, skal du passende øge eller mindske mængden af ​​skåret væv (valgfrit) Vælg 10~20 mg).
(4) Hvis fiskemuskler, rejekød, vandmænd og andet væv med højt vandindhold ekstraheres, bør prøvevolumenet øges passende (anbefalet 100-200 mg).
(5) Hvis forholdene tillader det, kan dyrevævet ekstraheres direkte efter at være blevet homogeniseret med en højpassagevævshomogenisator, hvis der ikke er et sådant udstyr.
(6) Det RNA, der er opnået efter den endelige ekstraktion, skal straks anbringes på isboksen for at reducere nedbrydningen af ​​RNA.

3. Dyrecelle-RNA-ekstraktion

(1) Suspensionsceller: centrifuger direkte og kassér mediet, vask med steril PBS i 1-2 gange, suspender derefter med en passende mængde PBS, og tilsæt derefter lysat til lysering.Tilsæt ikke lysatet direkte til de udfældede celler efter fuldstændig kassering af væsken.Dette vil få histonpakken, der frigives efter de lyserede celler på det ydre lag, til at klæbe til ydersiden af ​​de præcipiterede celler, hvorved kontakten mellem cellerne inde i pelleten og lysatet begrænses., hvilket resulterer i ufuldstændig cellelyse og reduceret RNA-udbytte.

(2) Celler, der er semi-adhærerende eller ikke tæt vedhæftende: Efter at have kasseret mediet, vask med PBS i 1-2 gange, absorber derefter direkte en passende mængde PBS og blæs dyrkningsskålen med en pipette eller pistol for at blæse cellerne af, og overfør dem til RNA-fri celler.Tilsæt lysatet til enzymets EP-rør til ekstraktion.

(3) Adhærente celler: skal først fordøjes med trypsin, derefter opsamles i RNase-fri EP-rør, centrifugeres for at fjerne supernatanten, vaskes 1-2 gange med PBS for at fjerne overskydende trypsin og resuspenderes med en passende mængde PBS Fortsæt derefter til ekstraktionstrinnet.

4. Plante-RNA-ekstraktion

Plantevæv er rigt på phenoliske forbindelser eller rige på polysaccharider eller indeholder nogle uidentificerede sekundære metabolitter eller har høj aktivitet af RNase.Disse stoffer er tæt kombineret med RNA efter cellelyse for at danne uopløselige komplekser eller kolloide bundfald, som er svære at fjerne.Derfor, når vi udvinder plantevæv, skal vi vælge et kit til planter.Lysatet i sættet kan effektivt løse problemerne med let oxidation af polyphenoler og adskillelse af polysaccharidforbindelser og nukleinsyrer.

(For polysaccharid polyphenol plante RNA ekstraktion, anbefalede produkter:

(1) Plantens skræl, frugtkød, frø, blade osv. skal males helt i en morter.Under formalingsprocessen skal flydende nitrogen fyldes på i tide for at undgå at prøven smelter.Den formalede prøve skal hurtigt tilsættes til lysatet og rystes for at undgå RNA-nedbrydning.

(2) For fiberrige prøver såsom ris og hvedeblade bør mængden af ​​ekstraktion reduceres passende, ellers vil vævsformningen og lyseringen ikke være fuldstændig, hvilket resulterer i et lavt udbytte af ekstraheret RNA.

(3) For plantevæv med højt vandindhold, såsom granatæblefrugt, vandmelonfrugt, ferskenfrugt osv., bør prøvestørrelsen øges passende (100-200 mg er valgfrit).

(4) Plantevæv, såsom planteblade, jordstængler, hårde frugter og andre materialer anbefales generelt at bruge flydende nitrogen til at mørle ingredienserne grundigt i en morter og derefter fortsætte til ekstraktionstrinnet.Konventionelle vævshomogenisatorer er muligvis ikke effektive til at homogenisere plantevæv og anbefales generelt ikke.

5. Forholdsregler for RNA-ekstraktion

(1) Vævsprøver bør være så friske som muligt for at undgå gentagen frysning og optøning.

(2) Vævet skal være fuldt formalet under ekstraktion, og mængden af ​​væv bør ikke være for lidt, endsige for meget.

(3) Der bør gives tilstrækkelig inkubationstid efter tilsætning af lysatet til at lysere prøven fuldstændigt.

(4) Ved anvendelse af Trizol-metoden til ekstraktion er princippet om at absorbere supernatanten efter stratificering "foretrækker at inhalere mindre end inhalere mere", og må ikke ekstraheres til mellemlaget, da det ellers vil forårsage alvorlig genomisk DNA-kontamination.

(5) Ved vask skal vaskevæsken helt infiltrere rundt om rørvæggen for at sikre grundig vask.

(6) Ved kolonneekstraktionsmetoden skal adsorptionssøjlen ud over at løsne kolonnen efter vask også placeres i en ultra-ren bænk og blæses i 5-10 minutter for fuldstændigt at fordampe det organiske opløsningsmiddel til tørhed.

(7) Ved den sidste eluering af kolonnemetoden, efter tilsætning af DEPC-vand, skal det inkuberes i 3-5 minutter, eller DEPC-vandet skal opvarmes til 60°C på forhånd for at øge elueringsudbyttet.I den traditionelle Trizol-spaltnings- og isopropanoludfældningsmetode opløses det endelige RNA i DEPC-vand, så der bør gives en passende tid til opløsning, og bunden af ​​centrifugerøret skal blæses kontinuerligt med en pipettespids.

3 Ttre årsager og løsninger til lav RNA-koncentration/dårlig kvalitet
 
1. Udbyttet er for lavt
Den ekstraherede prøve er for lav, den samlede mængde er utilstrækkelig, eller den ekstraherede prøve er for meget, og lyseringen er ikke fuldstændig;vævet eller cellerne af passende kvalitet skal bruges til ekstraktion, forbehandlingen af ​​prøven skal udføres godt, og lyseringen skal være tilstrækkelig.
 
2. Genomrester
Ved ekstraktion ved Trizol-metoden, når supernatanten suges ind i mellemlaget efter lagdeling, vil der opstå alvorlig genomkontamination;ekstra forsigtighed bør udvises ved lagdeling for at undgå at suge ind i mellemlaget.Hvis kolonnemetoden anvendes til ekstraktion, kan et kit indeholdende DNase I udvælges til ekstraktion.Nukleinsyren, der er adsorberet på membranen, fordøjes direkte med DNase I, hvilket i høj grad kan reducere DNA-rester.
 
3. RNA-nedbrydning
Det kan være nedbrydningen af ​​selve den ekstraherede prøve eller nedbrydningen forårsaget under ekstraktionsprocessen;Så vidt muligt bør friske prøver anvendes til RNA-ekstraktion, og de indsamlede prøver bør opbevares i flydende nitrogen eller -80°C køleskab i tide, og gentagen frysning og optøning bør undgås.RNase/DNase-frie spidser, centrifugerør og andre materialer bør anvendes i RNA-ekstraktionsprocessen.Udvindingsprocessen skal være så hurtig som muligt.Det ekstraherede RNA skal placeres på en isboks og opbevares ved -80 i tid.Hvis det ekstraherede RNA skal påvises ved gelelektroforese, skal elektroforese udføres umiddelbart efter ekstraktion, og elektroforesebufferen skal erstattes med en nyfremstillet.
 
4. Salt og rester af organisk opløsningsmiddel
Ekstraktionsreagenserne indeholder phenol- og guanidinsalte, og vaskeopløsningen indeholder ethanol.Under ekstraktionsprocessen blev lysatet ikke fuldstændigt absorberet og kasseret, og vaskeopløsningen var ikke helt tørret.Resterende salte og organiske opløsningsmidler er skadelige for efterfølgende revers transkription og PCR.Forskellige grader af hæmning, så vævslysatet skal fjernes helt under ekstraktionsprocessen, og vaskningen skal være tilstrækkelig til, at de omgivende vægge af røret kan vaskes.Derudover tømmes røret og blæst er et nødvendigt skridt, som yderligere vil reducere resterne af organisk stof.
 
For mere information om RNA-ekstraktion, følg venligst vores hjemmeside:
www.foreivd.com for mere information.

7

Posttid: Dec-01-2022