Det enestående træk ved PCR-reaktionen er dens store amplifikationskapacitet og ekstremt høje følsomhed.For at forbedre PCR-ydelsen og detektionseffektiviteten er vi forpligtet til at forbedre PCR-amplifikationskapaciteten og detektionsfølsomheden, men hovedpinen er i gang med eksperimentet.Falske positiver forekommer ofte, og en meget lille mængde prøvekrydskontaminering eller PCR-produktkontamination kan forårsage falske positiver i eksperimentet.
Fem typer PCR-produktkontamination
Der er mange årsager til PCR-kontamination, som groft kan opdeles i følgende kategorier:
Prøvekontaminering er hovedsageligt forårsaget af kontaminering af beholderen til opsamling af prøven, eller når prøven placeres, lækkes den ud af beholderen på grund af løs forsegling, eller prøven klæbes til ydersiden af beholderen, hvilket forårsager krydskontaminering;Kontaminering fører til kontaminering mellem prøver;nogle mikrobielle prøver, især vira, kan spredes med aerosoler eller danne aerosoler, hvilket resulterer i gensidig kontaminering.
Hovedårsagen er, at prøvepistolen, beholderen, dobbeltdestilleret vand og andre opløsninger er kontamineret af PCR-nukleinsyreskabelonen under fremstillingen af PCR-reagenser.
I molekylærbiologiske laboratorier og nogle laboratorier, der bruger klonede plasmider som positive kontroller, er problemet med klonet plasmidkontamination også almindeligt.Fordi indholdet af kloningsplasmid i enhedsvolumen er ret højt, og der er behov for flere værktøjer og reagenser i oprensningsprocessen, og plasmidet i levende celler er meget sandsynligt forurenet på grund af levende cellers stærke vækst og reproduktionsevne.
Kontamineringen af amplificerede produkter er det mest almindelige kontamineringsproblem i PCR-reaktioner.Fordi kopimængden af PCR-produkt er stor (generelt 1013 kopier/ml), hvilket er langt højere end grænsen for PCR-detektionskopiantal, kan en meget lille mængde PCR-produktkontamination forårsage falske positiver.
Aerosolforurening er den mest sandsynlige form for forurening af PCR-produkter, og den er også den letteste at blive overset.Det dannes af friktionen mellem væskeoverfladen og luften.Generelt kan der dannes aerosolkontamination, når låget åbnes, når prøven aspireres, eller endda når reaktionsrøret rystes kraftigt.Ifølge beregninger kan en aerosolpartikel indeholde 48.000 eksemplarer, så forureningen forårsaget af den er et problem, der fortjener særlig opmærksomhed.
Især testlaboratorier bruger ofte det samme par primere til at teste et bestemt gen.Over tid vil der forekomme en stor mængde PCR-produktkontamination i laboratorierummet.Når en sådan forurening først opstår, er det vanskeligt at fjerne det på kort tid.
For de første tre typer forurening kan vi bruge effektive midler til at undgå, men forureningen forårsaget af PCR-produkter er svær at forhindre, især i opførelsen af ikke-standard PCR-laboratorier.I PCR-processen, når pipettespidsen suger og blæser væsken, og PCR-rørets dæksel åbnes, vil der dannes en aerosol.De DNA-molekyler, som aerosolen bærer (en aerosol kan bære titusindvis af DNA) er svære at fjerne, fordi de flyder i luften.Når den næste runde af PCR-eksperimenter er introduceret, vil falske positiver uundgåeligt forekomme.
Som vist i figuren nedenfor forstærkede den negative kontrol også det tilsvarende bånd af interesse:
Den første del af dette nummer om PCR-forurening og forebyggelse introduceres her.Det næste nummer vil bringe dig den anden del "Forebyggelse af PCR-produktkontamination", så følg med!
Indlægstid: 25-jul-2017
