Forfattere: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu
Enhed: Jiaozhou Hospital, Dongfang Hospital tilknyttet Tongji University
På nuværende tidspunkt er den primære prøvetype til påvisning af respiratorisk patogen nukleinsyre halspodning.Der er mange slags almindeligt anvendte prøvekonserveringsløsninger, som alle skal nedkøles eller fryses til transport og opbevaring;Det er svært at kontrollere hele processen med lav temperatur under indsamlings- og transportprocessen, og det er vanskeligt at sikre kvalitetskontrollen før prøvetestning[1-2].
RNase (RNase) er en endonuklease, der hydrolyserer RNA, hovedsageligt adskiller phosphodiester-bindinger mellem nukleotider.RNase-molekylet er meget stabilt, der er disulfidbindinger i strukturen, og dets aktivitet kræver ikke tilstedeværelsen af divalente kationer, så RNase denatureres ikke let, og det er let at renaturere selv efter høj temperatur eller brug af denatureringsmidler.RNaser er opdelt i endogene og eksogene.De endogene RNaser kan frigives på samme tid, når celler sprænges.Derfor er eliminering af rollen som endogene RNaser et meget kritisk trin i RNA-ekstraktionsprocessen.Eksogene RNaser er vidt udbredt.RNaser findes i luften, menneskets hud, hår og spyt, hvilket er vigtige årsager til den lette nedbrydning af RNA[3].
Dataforespørgsel
CANS-CL02-A009 "Anvendelse af retningslinjer for medicinsk laboratoriekvalitet og kompetenceakkreditering inden for molekylær diagnose" i de tekniske krav foreslår, at passende vandkvalitetsstandarder skal formuleres i overensstemmelse med applikationen;Engangs lufttætte beholdere:
RNase/klassificering
(1) RNase A
Ribonuklease A (RNase A), afledt af bovin bugspytkirtel, er en endoribonuklease, der specifikt kan angribe 3'-enden af pyrimidinrester på RNA, skære cytosin eller uracil dannet af tilstødende nukleotider.Phosphodiesterbinding, slutproduktet af reaktionen er et 3'-pyrimidinnukleotid og et oligonukleotid med et 3'-pyrimidinnukleotid for enden.
(2) RNase T1
Ribonuklease T1 (RNase T1) er afledt af Aspergillus orjzae, den virker specifikt på det 3'-terminale fosfat af guanin, og spaltningsstedet er mellem 3'-fosfat af guanin og 5'-hydroxyl af tilstødende nukleotider.Slutproduktet af reaktionen er 3'guanylsyre og oligonukleotidfragmenter med 3'guanylsyre til sidst.
(3) RNase H
Ribonuclease H (RNase H) blev først opdaget fra kalvethymusvæv, og dets kodende gen er blevet klonet ind i Escherichia coli.Det kan specifikt nedbryde DNA: RNA-strenge i RNA-hybridduplekser, hvilket resulterer i oligonukleotider og mononukleotider med 3'-OH og 5'-monophosphat-ender, det kan ikke nedbryde enkelt- eller dobbeltstrenget DNA eller RNA.
RNase
Funktion og brug
Ribonuklease kan katalysere nedbrydningen af ribonukleinsyre (RNA) og kan syntetiseres kunstigt.Medicinsk salve bruges topisk til behandling af traumer og ledsmerter.Ifølge rapporter kan ribonuklease ændre værtscellemetabolisme, hæmme virussyntese, hæmme spredningen af influenzavirus in vitro og hæmme dannelsen af vaccinia- og herpesvirus i kyllingeembryoner.Klinisk brug af ribonuklease daglig intramuskulær injektion på 180 mg, gavnlig til behandling af epidemisk encephalitis, ribonuklease kan katalysere nedbrydningen af ribonukleinsyre (RNA), og kan nu syntetiseres kunstigt.Medicinsk salve bruges topisk til behandling af traumer og ledsmerter.Ifølge rapporter kan ribonuklease ændre værtscellemetabolisme, hæmme virussyntese, hæmme spredningen af influenzavirus in vitro og hæmme dannelsen af vaccinia- og herpesvirus i kyllingeembryoner.Klinisk brug af ribonuklease daglig intramuskulær injektion på 180 mg er gavnlig til behandling af epidemisk hjernebetændelse.
RNase
Definition af inhibitor
Definition af RNase-hæmmerenhed: Mængden af enzym, der kræves for at hæmme 50 % af aktiviteten af 5 ng RNase A, er én enhed.
Hvordan RNase-hæmmere virker
Guanidin isothiocyanat:
Guanidin isothiocyanat er en organisk forbindelse med molekylformlen C2H6N4S.Anvendes hovedsageligt i biologisk medicin, kemiske reagenser osv. Guanidinisothiocyanat er et proteinlyseringsmiddel, og det bruges ofte som hovedbestanddelen af lyseringsopløsning i molekylærdiagnostiske reagenser.Det kan lysere væv, ødelægge cellestruktur og adskille nukleinsyre fra nukleoprotein og har stærk denaturering til RNase.Det er den mest effektive RNase-hæmmer på nuværende tidspunkt.
TRIzol er et nyt total-RNA-ekstraktionsreagens, der direkte kan ekstrahere total-RNA fra celler eller væv.Det indeholder stoffer som phenol og guanidin isothiocyanat, som hurtigt kan forstyrre celler og hæmme nukleaser frigivet af celler.
(Guanidin isothiocyanat er dog farligt for laboratorieforskeres helbred.)
RNAsin:
Surt glycoprotein ekstraheret fra rottelever eller human blastoderm.Rnasin er en ikke-kompetitiv hæmmer af RNase, som kan binde til forskellige RNaser for at inaktivere dem.
(Flere detaljer: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)
Hhøj temperatur:
Høj temperatur er også et almindeligt middel til proteindenaturering.
Diethylpyrocarbonat (DEPC):
DEPC er en stærk, men ufuldstændig RNase-hæmmer, som kan hæmme RNase-aktivitet ved at kombinere med aminosyre-imidazolringen i den aktive RNase-gruppe for at denaturere proteiner.
Vanadylribonukleosidkompleks:
Et kompleks dannet af vanadiumoxidioner og nukleosider, som binder sig til RNase i form af overgangsstoffer, som næsten fuldstændigt kan hæmme RNases aktivitet
Andet:
SDS, urinstof, diatoméjord osv. har også en vis hæmmende effekt på RNase.
Ekspertanmeldelser
Li Yujie cheftekniker
Direktør for laboratorieafdelingen, Jiaozhou Hospital, Dongfang Hospital, tilknyttet Tongji University
For at forhindre biologisk nedbrydning af eksogen RNase, bør masker, handsker og hatte bæres og udskiftes ofte under RNA-ekstraktionsprocessen.Alle glasvarer skal bages i en tørreovn ved 200°C i mere end 2 timer.Materialer, der bruges til bagning, såsom plastik, skal behandles med DEPC-vand og derefter vaskes med destilleret vand.De reagenser eller anordninger, der bruges til ekstraktion, konservering og identifikation af RNA, bør dedikeres til RNA, og der bør oprettes et uafhængigt RNA-driftsområde.
referencer:
[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bakterier og vira i nasopharynx umiddelbart før debut af akutte nedre luftvejsinfektioner hos oprindelige australske børn[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018,37 (9): 1785-1794.
[2] Hospital Infection Control Branch of Chinese Preventive Medicine Association.Retningslinjer for indsamling og inspektion af kliniske mikrobielle prøver [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.
[3] "Klinisk test Ten Thousand Why Molecular Biology Test Volume"
Indlægstid: Aug-09-2022